Ang mga immunomodulatory metabolite usa ka importanteng bahin sa tumor microenvironment (TME), apan gawas sa pipila ka eksepsiyon, ang ilang mga identidad wala pa kaayo mailhi. Dinhi, among gisusi ang mga tumor ug T cell gikan sa mga tumor ug ascites sa mga pasyente nga adunay high-grade serous carcinoma (HGSC) aron ipadayag ang metabolome niining lain-laing mga TME compartment. Ang mga ascite ug tumor cell adunay daghang kalainan sa metabolite. Kung itandi sa ascites, ang mga tumor-infiltrating T cell adunay dakong kantidad sa 1-methylnicotinamide (MNA). Bisan kung taas ang lebel sa MNA sa mga T cell, ang ekspresyon sa nicotinamide N-methyltransferase (usa ka enzyme nga nag-catalyze sa pagbalhin sa mga methyl group gikan sa S-adenosylmethionine ngadto sa nicotinamide) limitado sa mga fibroblast ug tumor cell. Sa functionality, ang MNA nag-induce sa mga T cell sa pagpagawas sa tumor-promoter cytokine tumor necrosis factor alpha. Busa, ang TME-derived MNA nakatampo sa immune regulation sa mga T cell ug nagrepresentar sa usa ka potensyal nga target sa immunotherapy alang sa pagtambal sa kanser sa tawo.
Ang mga metabolite nga gikan sa tumor mahimong adunay dakong epekto sa pagpugong sa resistensya batok sa tumor, ug nagkadaghan ang ebidensya nga nagpakita nga mahimo usab kini nga magsilbing hinungdanon nga kusog sa pag-uswag sa sakit (1). Gawas sa epekto sa Warburg, ang bag-o nga trabaho nagsugod sa pag-ila sa kahimtang sa metabolismo sa mga selula sa tumor ug ang relasyon niini sa kahimtang sa resistensya sa tumor microenvironment (TME). Ang mga pagtuon sa mga modelo sa ilaga ug mga selula sa T sa tawo nagpakita nga ang metabolismo sa glutamine (2), oxidative metabolism (3) ug metabolismo sa glucose (4) mahimong molihok nga independente sa lainlaing mga subgroup sa selula sa resistensya. Daghang mga metabolite niini nga mga agianan ang nagpugong sa function sa anti-tumor sa mga selula sa T. Napamatud-an nga ang pagbabag sa coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) makadaot sa pagdaghan sa mga selula sa T, ug ang pagtaas sa BH4 sa lawas makapausbaw sa tubag sa resistensya batok sa tumor nga gipaagi sa CD4 ug CD8. Dugang pa, ang immunosuppressive nga epekto sa kynurenine mahimong maluwas pinaagi sa administrasyon sa BH4 (5). Sa isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma, ang pagtago sa enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) nagpugong sa pagpaaktibo, pagdaghan, ug cytolysis Activity sa T cell (6). Bag-ohay lang, gipakita nga ang methylglyoxal, usa ka by-product sa glycolysis, gihimo sa mga suppressor cell nga gikan sa myeloid, ug ang pagbalhin sa T cell sa methylglyoxal makapugong sa function sa effector T cell. Sa pagtambal, ang neutralization sa methylglyoxal makabuntog sa kalihokan sa myeloid-derived suppressor cells (MDSC) ug makapalambo sa checkpoint blockade therapy sa mga modelo sa ilaga (7). Kini nga mga pagtuon naghatag og gibug-aton sa importanteng papel sa mga metabolite nga gikan sa TME sa pag-regulate sa function ug kalihokan sa T cell.
Ang T cell dysfunction kay kaylap nga gitaho sa kanser sa obaryo (8). Kini tungod sa metabolic characteristics nga anaa sa hypoxia ug abnormal tumor vasculature (9), nga moresulta sa pagkakabig sa glucose ug tryptophan ngadto sa mga by-product sama sa lactic acid ug kynurenine. Ang sobra nga extracellular lactate makapakunhod sa produksiyon sa interferon-γ (IFN-γ) ug makapadali sa pagkalahi sa myelosuppressive subgroups (10, 11). Ang pagkonsumo sa tryptophan direktang nagpugong sa pagdaghan sa T cell ug nagpugong sa T cell receptor signaling (12-14). Bisan pa niini nga mga obserbasyon, daghang trabaho nga naglibot sa immune metabolism ang gihimo sa in vitro T cell culture gamit ang optimized media, o limitado sa homologous mouse models in vivo, nga wala niini hingpit nga nagpakita sa heterogeneity sa mga kanser sa tawo ug Physiological macro ug micro environment.
Usa ka komon nga bahin sa kanser sa obaryo mao ang peritoneal spread ug ang pagpakita sa ascites. Ang pagtapok sa cell fluid sa ascites nalangkit sa advanced disease ug dili maayo nga prognosis (15). Sumala sa mga report, kini nga talagsaon nga compartment kay hypoxic, adunay taas nga lebel sa vascular endothelial growth factor (VEGF) ug indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), ug gisulod sa mga T regulatory cells ug myeloid inhibitory cells (15-18). Ang metabolic environment sa ascites mahimong lahi sa tumor mismo, busa ang reprogramming sa mga T cells sa peritoneal space dili klaro. Dugang pa, ang mga nag-unang kalainan ug heterogeneity tali sa ascites ug metabolites nga anaa sa tumor environment mahimong makababag sa pag-infiltration sa mga immune cells ug sa ilang function sa mga tumor, ug dugang nga panukiduki ang gikinahanglan.
Aron masulbad kini nga mga problema, nagdisenyo kami og usa ka sensitibo nga cell separation ug liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) nga pamaagi aron tun-an ang lainlaing mga tipo sa selula (lakip ang CD4 + ug CD8 + T cells) ingon man sa sulod ug taliwala sa mga tumor. Ang mga metabolite niini mokatap sa mga selula sa parehas nga ascites ug palibot sa tumor sa pasyente. Gigamit namo kini nga pamaagi kauban ang high-dimensional flow cytometry ug single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) aron makahatag og usa ka hingpit nga repleksyon sa metabolic status niining mga importanteng populasyon. Kini nga pamaagi nagpadayag sa usa ka hinungdanon nga pagtaas sa lebel sa 1-methylnicotinamide (MNA) sa mga tumor T cells, ug ang mga in vitro nga eksperimento nagpakita nga ang immunomodulatory nga epekto sa MNA sa function sa T cell wala pa mahibal-i kaniadto. Sa kinatibuk-an, kini nga pamaagi nagpadayag sa usag usa nga metabolic interaction tali sa mga tumor ug mga immune cell, ug naghatag og talagsaon nga mga panabut sa mga immune regulation metabolite, nga mahimong mapuslanon alang sa pagtambal sa T cell-based ovarian cancer immunotherapy nga mga oportunidad sa pagtambal.
Gigamit namo ang high-dimensional flow cytometry aron dungan nga masukod ang glucose uptake [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ug mitochondrial activity [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) mga tipikal nga marker nga nagpalahi sa mga immune cell ug mga populasyon sa tumor cell (Table S2 ug Figure S1A). Kini nga pag-analisa nagpakita nga kon itandi sa mga T cell, ang ascites ug tumor cells adunay mas taas nga lebel sa glucose uptake, apan adunay gamay nga kalainan sa mitochondrial activity. Ang aberids nga glucose uptake sa mga tumor cells [CD45-EpCAM (EpCAM)+] tulo ngadto sa upat ka pilo kay sa mga T cells, ug ang aberids nga glucose uptake sa mga CD4 + T cells kay 1.2 ka pilo kay sa mga CD8 + T cells, nga nagpakita nga ang Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) adunay lain-laing metabolic requirements bisan sa parehas nga TME (Figure 1A). Sa kasukwahi, ang mitochondrial activity sa mga tumor cell susama sa CD4 + T cells, ug ang mitochondrial activity sa duha ka klase sa cell mas taas kay sa CD8 + T cells (Figure 1B). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagpadayag sa metabolic level. Ang metabolic activity sa mga tumor cells mas taas kay sa CD4 + T cells, ug ang metabolic activity sa CD4 + T cells mas taas kay sa CD8 + T cells. Bisan pa niini nga mga epekto sa lain-laing klase sa cell, walay makanunayon nga kalainan sa metabolic status sa CD4 + ug CD8 + T cells o sa ilang relatibong proporsyon sa ascites kon itandi sa mga tumor (Figure 1C). Sa kasukwahi, sa CD45-cell fraction, ang proporsyon sa EpCAM+ cells sa tumor misaka kon itandi sa ascites (Figure 1D). Nakakita usab kami og klaro nga metabolic difference tali sa EpCAM+ ug EpCAM- cell components. Ang EpCAM+ (tumor) cells adunay mas taas nga glucose uptake ug mitochondrial activity kay sa EpCAM- cells, nga mas taas kay sa metabolic activity sa fibroblasts sa tumor cells sa TME (Figure 1, E ug F).
(A ug B) Median fluorescence intensity (MFI) sa glucose uptake (2-NBDG) (A) ug mitochondrial activity sa CD4 + T cells (MitoTracker dark red) (B) Representative graphs (wala) ug tabulated data (Tuo), CD8 + T cells ug EpCAM + CD45-tumor cells gikan sa ascites ug tumor. (C) Ang ratio sa CD4 + ug CD8 + cells (sa CD3 + T cells) sa ascites ug tumor. (D) Proporsyon sa EpCAM + tumor cells sa ascites ug tumor (CD45−). (E ug F) EpCAM + CD45-tumor ug EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) ug mitochondrial activity (MitoTracker dark red) (F) representative graphs (wala) ug tabulated data (Tuo) Ascites ug tumor cells. (G) Representative graphs sa CD25, CD137 ug PD1 expression pinaagi sa flow cytometry. (H ug I) Ekspresyon sa CD25, CD137 ug PD1 sa mga CD4 + T cells (H) ug CD8 + T cells (I). (J ug K) Mga phenotype sa naive, central memory (Tcm), effector (Teff) ug effector memory (Tem) base sa ekspresyon sa CCR7 ug CD45RO. Mga representatibong imahe (wala) ug tabular data (tuo) sa mga CD4 + T cells (J) ug CD8 + T cells (K) sa mga ascites ug tumor. Ang mga P value gitino pinaagi sa paired t-test (*P<0.05, **P<0.01 ug ***P<0.001). Ang linya nagrepresentar sa gipares nga mga pasyente (n = 6). FMO, fluorescence minus one; MFI, median fluorescence intensity.
Ang dugang nga pag-analisar nagpadayag ug ubang mga hinungdanong kalainan tali sa highly resolved T cell phenotypic status. Ang activated (Figure 1, G to I) ug effector memory (Figure 1, J ug K) sa mga tumor mas kanunay kay sa ascites (proporsyon sa CD3 + T cells). Sa susama, ang pag-analisar sa phenotype pinaagi sa ekspresyon sa activation markers (CD25 ug CD137) ug depletion markers [programmed cell death protein 1 (PD1)] nagpakita nga bisan kung ang metabolic characteristics niining mga populasyon managlahi (Figure S1, B to E), walay hinungdanong metabolic differences nga kanunay nga naobserbahan tali sa naive, effector o memory subsets (Figure S1, F to I). Kini nga mga resulta gikumpirma pinaagi sa paggamit sa machine learning methods aron awtomatikong i-assign ang mga cell phenotype (21), nga dugang nagpadayag sa presensya sa daghang gidaghanon sa bone marrow cells (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) sa ascites sa pasyente (Figure S2A). Taliwala sa tanang nailhan nga mga tipo sa selula, kini nga populasyon sa myeloid cell nagpakita sa pinakataas nga glucose uptake ug mitochondrial activity (Figure S2, B hangtod G). Kini nga mga resulta nagpasiugda sa kusog nga mga kalainan sa metabolismo tali sa daghang mga tipo sa selula nga nakit-an sa ascites ug mga tumor sa mga pasyente sa HGSC.
Ang pangunang hagit sa pagsabot sa metabonomic nga mga kinaiya sa TIL mao ang panginahanglan sa pag-isolate sa mga sample sa T cell nga adunay igo nga kaputli, kalidad, ug gidaghanon gikan sa mga tumor. Ang bag-o nga mga pagtuon nagpakita nga ang mga pamaagi sa pag-sort ug bead enrichment base sa flow cytometry mahimong mosangpot sa mga pagbag-o sa mga profile sa cellular metabolite (22-24). Aron masulbad kini nga problema, among gi-optimize ang pamaagi sa bead enrichment aron i-isolate ug i-isolate ang TIL gikan sa surgically resected human ovarian cancer sa dili pa ang pag-analisa pinaagi sa LC-MS/MS (tan-awa ang Materials and Methods; Figure 2A). Aron masusi ang kinatibuk-ang epekto niini nga protocol sa mga pagbag-o sa metabolite, among gitandi ang mga profile sa metabolite sa mga T cell nga gi-activate sa himsog nga mga donor pagkahuman sa nahisgutang lakang sa pagbulag sa bead sa mga selula nga wala gibulag sa bead apan nagpabilin sa yelo. Kini nga pag-analisa sa quality control nakit-an nga adunay taas nga correlation tali niining duha ka kondisyon (r = 0.77), ug ang teknikal nga pagkabalik-balik sa grupo sa 86 ka metabolite adunay taas nga pagkabalik-balik (Figure 2B). Busa, kini nga mga pamaagi makahimo og tukmang pag-analisar sa metabolite sa mga selula nga gipailalom sa pagpalambo sa tipo sa selula, sa ingon naghatag sa unang plataporma nga adunay taas nga resolusyon alang sa pag-ila sa mga piho nga metabolite sa HGSC, sa ingon nagtugot sa mga tawo nga makakuha og mas lawom nga pagsabot sa espesipikong programa sa metabolismo sa sekso.
(A) Eskematikong diagram sa pagpayaman sa magnetic bead. Sa dili pa ang pag-analisa pinaagi sa LC-MS/MS, ang mga selula moagi sa tulo ka sunod-sunod nga hugna sa pagpayaman sa magnetic bead o magpabilin sa yelo. (B) Ang epekto sa tipo sa pagpayaman sa kadaghan sa mga metabolite. Ang aberids sa tulo ka sukod alang sa matag tipo sa pagpayaman ± SE. Ang gray nga linya nagrepresentar sa 1:1 nga relasyon. Ang intra-class correlation (ICC) sa balik-balik nga mga sukod nga gipakita sa axis label. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Eskematikong diagram sa workflow sa pag-analisa sa metabolite sa pasyente. Ang mga ascite o tumor gikolekta gikan sa mga pasyente ug gi-cryopreserve. Usa ka gamay nga bahin sa matag sample ang gi-analisa pinaagi sa flow cytometry, samtang ang nahabilin nga mga sample gi-analisa sa tulo ka hugna sa pagpayaman alang sa mga selula sa CD4+, CD8+ ug CD45-. Kini nga mga tipik sa selula gi-analisa gamit ang LC-MS/MS. (D) Heat map sa standardized metabolite abundance. Ang dendrogram nagrepresentar sa Ward's clustering sa Euclidean distances tali sa mga sample. (E) Pag-analisa sa pangunang sangkap (PCA) sa mapa sa metabolite sa sampol, nga nagpakita sa tulo ka replika sa matag sampol, ang mga sampol gikan sa parehas nga pasyente konektado sa usa ka linya. (F) Ang PCA sa profile sa metabolite sa sampol nga gikondisyon sa pasyente (pananglitan, gamit ang partial redundancy); ang tipo sa sampol gilimitahan sa convex hull. PC1, pangunang sangkap 1; PC2, pangunang sangkap 2.
Sunod, among gigamit kini nga pamaagi sa pagpayaman aron masusi ang 99 ka metabolite sa mga fraction sa CD4+, CD8+ ug CD45-cell sa mga primary ascites ug tumor sa unom ka pasyente sa HGSC (Figure 2C, Figure S3A ug Table S3 ug S4). Ang populasyon nga gikonsiderar nagkantidad og 2% hangtod 70% sa orihinal nga dako nga sample sa mga buhing selula, ug ang proporsyon sa mga selula managlahi kaayo tali sa mga pasyente. Human sa pagbulag sa mga beads, ang gipayaman nga fraction of interest (CD4+, CD8+ o CD45-) nagkantidad og labaw sa 85% sa tanan nga buhing selula sa sample sa aberids. Kini nga pamaagi sa pagpayaman nagtugot kanamo sa pag-analisar sa mga populasyon sa selula gikan sa metabolismo sa tisyu sa tumor sa tawo, nga imposible nga buhaton gikan sa dagkong mga sample. Gamit kini nga protocol, among natino nga ang l-kynurenine ug adenosine, kining duha ka maayo nga nailhan nga immunosuppressive metabolites, gipataas sa mga tumor T cells o mga tumor cells (Figure S3, B ug C). Busa, kini nga mga resulta nagpakita sa kamatinud-anon ug abilidad sa among teknolohiya sa pagbulag sa selula ug mass spectrometry aron makit-an ang mga importanteng metabolite sa biyolohikal sa mga tisyu sa pasyente.
Ang among pag-analisar nagpadayag usab og kusog nga metabolic separation sa mga tipo sa selula sulod ug taliwala sa mga pasyente (Figure 2D ug Figure S4A). Ilabi na, kon itandi sa ubang mga pasyente, ang pasyente 70 nagpakita og lain-laing metabolic characteristics (Figure 2E ug Figure S4B), nga nagpakita nga mahimong adunay dakong metabolic heterogeneity tali sa mga pasyente. Angayan nga matikdan nga kon itandi sa ubang mga pasyente (1.2 ngadto sa 2 ka litro; Table S1), ang kinatibuk-ang gidaghanon sa ascites nga nakolekta sa pasyente 70 (80 ml) mas gamay. Ang pagkontrol sa inter-patient heterogeneity atol sa principal component analysis (pananglitan, gamit ang partial redundancy analysis) nagpakita og makanunayon nga mga pagbag-o tali sa mga tipo sa selula, ug ang mga tipo sa selula ug/o microenvironment klaro nga gi-aggregate sumala sa metabolite profile (Figure 2F). Ang pag-analisar sa single metabolites nagpasiugda niini nga mga epekto ug nagpadayag og mga mahinungdanong kalainan tali sa mga tipo sa selula ug microenvironment. Angayan nga matikdan nga ang labing grabeng kalainan nga naobserbahan mao ang MNA, nga kasagaran gipadato sa mga CD45- cells ug sa mga CD4+ ug CD8+ cells nga mosulod sa tumor (Figure 3A). Para sa mga CD4 + cells, kini nga epekto mao ang labing klaro, ug ang MNA sa mga CD8 + cells daw kusog usab nga naapektuhan sa palibot. Bisan pa, dili kini importante, tungod kay tulo lang sa unom ka mga pasyente ang masusi alang sa mga marka sa tumor CD8+. Gawas sa MNA, sa lainlaing mga klase sa mga cells sa ascites ug tumors, ang ubang mga metabolite nga dili maayo nga mailhan sa TIL lainlain usab ang gidaghanon (Mga Figures S3 ug S4). Busa, kini nga datos nagpadayag sa usa ka maayong hugpong sa mga immunomodulatory metabolites alang sa dugang nga panukiduki.
(A) Na-normalize nga sulod sa MNA sa mga CD4+, CD8+ ug CD45- cells gikan sa ascites ug tumor. Ang box plot nagpakita sa median (line), interquartile range (frame hinge) ug data range, hangtod sa 1.5 ka pilo sa interquartile range (frame whisker). Sama sa gihulagway sa Patient Materials and Methods, gamita ang limma value sa pasyente aron mahibal-an ang P value (*P<0.05 ug **P<0.01). (B) Schematic diagram sa metabolismo sa MNA (60). Mga Metabolite: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Mga Enzyme (berde): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE sa scRNA-seq sa ascites (abohon) ug tumor (pula; n = 3 ka pasyente). (D) Ekspresyon sa NNMT sa lain-laing populasyon sa selula nga giila gamit ang scRNA-seq. (E) Ekspresyon sa NNMT ug AOX1 sa SK-OV-3, human embryonic kidney (HEK) 293T, T cells ug MNA-treated T cells. Ang folded expression gipakita relatibo sa SK-OV-3. Ang expression pattern sa SEM gipakita (n = 6 ka himsog nga donor). Ang mga Ct value nga labaw sa 35 giisip nga dili mamatikdan (UD). (F) Ekspresyon sa SLC22A1 ug SLC22A2 sa SK-OV-3, HEK293T, T cells ug T cells nga gitambalan og 8mM MNA. Ang napilo nga ekspresyon gipakita relatibo sa SK-OV-3. Ang sumbanan sa ekspresyon gamit ang SEM gipakita (n = 6 ka himsog nga donor). Ang mga kantidad sa Ct nga labaw sa 35 giisip nga dili mamatikdan (UD). (G) Ang sulud sa Cell MNA sa na-aktibo nga himsog nga donor T cells pagkahuman sa 72 ka oras nga incubation gamit ang MNA. Ang sumbanan sa ekspresyon gamit ang SEM gipakita (n = 4 ka himsog nga donor).
Ang MNA gihimo pinaagi sa pagbalhin sa methyl group gikan sa S-adenosyl-1-methionine (SAM) ngadto sa nicotinamide (NA) pinaagi sa nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figure 3B). Ang NNMT sobra nga gipahayag sa lain-laing mga kanser sa tawo ug nalangkit sa pagdaghan, pagsulong ug metastasis (25-27). Aron mas masabtan ang tinubdan sa MNA sa mga T cell sa TME, among gigamit ang scRNA-seq aron mailhan ang ekspresyon sa NNMT sa mga tipo sa selula sa ascites ug tumor sa tulo ka mga pasyente sa HGSC (Table S5). Ang pag-analisar sa gibana-bana nga 6,500 ka mga selula nagpakita nga sa mga ascites ug mga palibot sa tumor, ang ekspresyon sa NNMT limitado lamang sa gituohang mga populasyon sa fibroblast ug tumor cell (Figure 3, C ug D). Angayan nga matikdan nga walay klaro nga ekspresyon sa NNMT sa bisan unsang populasyon nga nagpahayag sa PTPRC (CD45 +) (Figure 3D ug Figure S5A), nga nagpakita nga ang MNA nga nakita sa metabolite spectrum gipaila sa mga T cell. Ang ekspresyon sa aldehyde oxidase 1 (AOX1) nag-convert sa MNA ngadto sa 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) o 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Figure 3B) limitado usab sa populasyon sa mga fibroblast nga nagpahayag sa COL1A1 (Figure S5A), nga nagpakita nga ang mga T cell kulang sa abilidad sa naandan nga metabolismo sa MNA. Ang sumbanan sa ekspresyon niining mga gene nga may kalabutan sa MNA gipamatud-an gamit ang ikaduhang independente nga datos sa selula gikan sa mga ascite gikan sa mga pasyente sa HGSC (Figure S5B; n = 6) (16). Dugang pa, ang quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis sa himsog nga donor T cells nga gitambalan sa MNA nagpakita nga kon itandi sa control SK-OV-3 ovarian tumor cells, ang NNMT o AOX1 halos wala gipahayag (Figure 3E). Kini nga wala damha nga mga resulta nagpakita nga ang MNA mahimong ipagawas gikan sa mga fibroblast o tumor ngadto sa kasikbit nga mga T cell sa TME.
Bisan tuod ang mga kandidato naglakip sa pamilya sa mga organic cation transporter 1 hangtod 3 (OCT1, OCT2 ug OCT3) nga gi-encode sa soluble carrier 22 (SLC22) nga pamilya (SLC22A1, SLC22A2 ug SLC22A3), ang mga potensyal nga transporter sa MNA wala pa gihapon matino (28). Ang QPCR sa mRNA gikan sa himsog nga donor T cells nagpakita og ubos nga lebel sa ekspresyon sa SLC22A1 apan dili mamatikdan nga lebel sa SLC22A2, nga nagpamatuod nga kini gitaho na kaniadto sa literatura (Figure 3F) (29). Sa kasukwahi, ang SK-OV-3 ovarian tumor cell line nagpahayag og taas nga lebel sa duha ka transporter (Figure 3F).
Aron masulayan ang posibilidad nga ang mga T cell adunay abilidad sa pagsuhop sa langyaw nga MNA, ang himsog nga donor T cells gi-culture sulod sa 72 ka oras sa presensya sa lain-laing konsentrasyon sa MNA. Sa kawalay exogenous MNA, ang cellular content sa MNA dili mamatikdan (Figure 3G). Bisan pa, ang mga activated T cells nga gitambalan og exogenous MNA nagpakita og dose-dependent nga pagtaas sa MNA content sa mga cells, hangtod sa 6 mM MNA (Figure 3G). Kini nga resulta nagpakita nga bisan pa sa ubos nga lebel sa transporter expression ug kakulang sa pangunang enzyme nga responsable sa intracellular MNA metabolism, ang TIL makasuhop gihapon sa MNA.
Ang spectrum sa mga metabolite sa mga T cell sa mga pasyente ug in vitro nga mga eksperimento sa pagsuhop sa MNA nagdugang sa posibilidad nga ang mga cancer-associated fibroblast (CAF) nagpagawas sa MNA ug ang mga tumor cell mahimong mag-regulate sa phenotype ug function sa TIL. Aron mahibal-an ang epekto sa MNA sa mga T cell, ang himsog nga donor T cells gi-activate in vitro sa presensya o pagkawala sa MNA, ug ang ilang pagdaghan ug produksiyon sa cytokine gisusi. Pagkahuman sa 7 ka adlaw nga pagdugang sa MNA sa labing taas nga dosis, ang gidaghanon sa pagdoble sa populasyon mikunhod og kasarangan, samtang ang kusog gipadayon sa tanan nga dosis (Figure 4A). Dugang pa, ang pagtambal sa exogenous MNA miresulta sa pagtaas sa proporsyon sa mga CD4 + ug CD8 + T cells nga nagpahayag sa tumor necrosis factor-α (TNFα; Figure 4B). Sa kasukwahi, ang intracellular nga produksiyon sa IFN-γ mikunhod pag-ayo sa mga CD4 + T cells, apan dili sa mga CD8 + T cells, ug walay dakong pagbag-o sa interleukin 2 (IL-2; Figure 4, C ug D). Busa, ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sa mga supernatant gikan niining mga MNA-treated T cell cultures nagpakita og dakong pagtaas sa TNFα, pagkunhod sa IFN-γ, ug walay pagbag-o sa IL-2 (Figure 4, E hangtod G). Ang pagkunhod sa IFN-γ nagpakita nga ang MNA mahimong adunay papel sa pagpugong sa anti-tumor activity sa mga T cell. Aron ma-simulate ang epekto sa MNA sa T cell-mediated cytotoxicity, ang chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) cells nga nagtumong sa folate receptor α ug CAR-T (GFP) nga gi-regulate sa green fluorescent protein (GFP) -CAR-T) cells gihimo sa himsog nga donor peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Ang mga CAR-T cells gi-culture sulod sa 24 oras sa presensya sa MNA, ug dayon gi-co-culture sa human SK-OV-3 ovarian tumor cells nga nagpahayag sa folate receptor α sa effector to target ratio nga 10:1. Ang pagtambal sa MNA miresulta sa dakong pagkunhod sa kalihokan sa pagpatay sa mga selula sa FRα-CAR-T, nga susama sa mga selula sa FRα-CAR-T nga gitambalan og adenosine (Figure 4H).
(A) Kinatibuk-ang ihap sa mabuhi nga selula ug pagdoble sa populasyon (PD) direkta gikan sa kultura sa ika-7 nga adlaw. Ang bar graph nagrepresentar sa mean + SEM sa unom ka himsog nga donor. Nagrepresentar sa datos gikan sa labing menos n = 3 ka independente nga mga eksperimento. (B hangtod D) Ang CD3/CD28 ug IL-2 gigamit aron ma-aktibo ang mga T cell sa ilang tagsatagsa ka konsentrasyon sa MNA sulod sa 7 ka adlaw. Sa wala pa ang pag-analisar, ang mga selula gi-stimulate gamit ang PMA/ionomycin gamit ang GolgiStop sulod sa 4 ka oras. Ekspresyon sa TNFα (B) sa mga T cell. Pananglitan nga imahe (wala) ug tabular nga datos (tuo) sa ekspresyon sa TNFα sa buhing mga selula. Ekspresyon sa IFN-γ (C) ug IL-2 (D) sa mga T cell. Ang ekspresyon sa mga cytokine gisukod pinaagi sa flow cytometry. Ang bar graph nagrepresentar sa mean (n = 6 ka himsog nga donor) + SEM. Gamita ang one-way analysis of variance ug repeated measures (*P<0.05 ug **P<0.01) aron mahibal-an ang P value. Nagrepresentar sa datos gikan sa labing menos n = 3 ka independente nga mga eksperimento. (E ngadto sa G) Ang CD3/CD28 ug IL-2 gigamit aron ma-activate ang mga T cell sa ilang tagsa-tagsa ka konsentrasyon sa MNA sulod sa 7 ka adlaw. Ang medium gikolekta sa wala pa ug pagkahuman sa 4 ka oras nga PMA/ionomycin stimulation. Ang mga konsentrasyon sa TNFα (E), IFN-γ (F) ug IL-2 (G) gisukod pinaagi sa ELISA. Ang bar graph nagrepresentar sa mean (n = 5 healthy donors) + SEM. Ang P value gitino gamit ang one-way analysis of variance ug balik-balik nga mga pagsukod (*P<0.05). Ang tuldok-tuldok nga linya nagpakita sa detection limit sa detection. (H) Cell lysis assay. Ang FRα-CAR-T o GFP-CAR-T cells gi-adjust gamit ang adenosine (250μM) o MNA (10 mM) sulod sa 24 oras, o wala matambalan (Ctrl). Ang porsyento sa pagpatay sa SK-OV-3 cells gisukod. Ang P value gitino pinaagi sa Welch t test (*P<0.5 ug **P<0.01).
Aron makakuha og mekanistikong pagsabot sa regulasyon sa ekspresyon sa TNFα nga nagsalig sa MNA, gisusi ang mga pagbag-o sa TNFα mRNA sa mga T cell nga gitambalan sa MNA (Figure 5A). Ang himsog nga mga donor T cell nga gitambalan og MNA nagpakita og doble nga pagtaas sa lebel sa transkripsyon sa TNFα, nga nagpakita nga ang MNA nagsalig sa regulasyon sa transkripsyon sa TNFα. Aron imbestigahan kini nga posible nga mekanismo sa regulasyon, duha ka nailhan nga mga transcription factor nga nag-regulate sa TNFα, nga mao ang activated T cell nuclear factor (NFAT) ug specific protein 1 (Sp1), gisusi isip tubag sa pagbugkos sa MNA sa proximal TNFα promoter (30). Ang TNFα promoter adunay 6 ka nailhan nga NFAT binding sites ug 2 ka Sp1 binding sites, nga nagsapaw sa usa ka site [-55 base pairs (bp) gikan sa 5'cap] (30). Ang Chromatin immunoprecipitation (ChIP) nagpakita nga sa dihang gitambalan og MNA, ang pagbugkos sa Sp1 sa TNFα promoter misaka og tulo ka pilo. Ang paglakip sa NFAT misaka usab ug nagkaduol sa kahinungdanon (Figure 5B). Kini nga datos nagpakita nga ang MNA nag-regulate sa ekspresyon sa TNFα pinaagi sa Sp1 transcription, ug sa gamay nga sukod sa ekspresyon sa NFAT.
(A) Kon itandi sa mga T cell nga gikultura nga walay MNA, ang pag-usab-usab sa ekspresyon sa TNFα sa mga T cell nga gitambalan og MNA. Ang sumbanan sa ekspresyon gamit ang SEM gipakita (n = 5 ka himsog nga donor). Nagrepresentar sa datos gikan sa labing menos n = 3 ka independente nga mga eksperimento. (B) Ang TNFα promoter sa mga T cell nga gitambalan nga adunay o walay 8 mM MNA human sa NFAT ug Sp1 gihiusa sa (Ctrl) ug PMA/ionomycin stimulation sulod sa 4 ka oras. Ang Immunoglobulin G (IgG) ug H3 gigamit isip negatibo ug positibo nga mga kontrol para sa immunoprecipitation, matag usa. Ang quantification sa ChIP nagpakita nga ang pagbugkos sa Sp1 ug NFAT sa TNFα promoter sa mga selula nga gitambalan og MNA misaka sa makadaghang higayon kon itandi sa kontrol. Nagrepresentar sa datos gikan sa labing menos n = 3 ka independente nga mga eksperimento. Ang P value gitino pinaagi sa daghang t-tests (*** P <0.01). (C) Kon itandi sa ascites sa HGSC, ang mga T cell (dili cytotoxic) nagpakita og dugang nga ekspresyon sa TNF sa tumor. Ang mga kolor nagrepresentar sa lain-laing mga pasyente. Ang gipakita nga mga selula gi-random nga gi-sample ngadto sa 300 ug gi-jitter aron limitahan ang overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Gisugyot nga modelo sa MNA para sa kanser sa obaryo. Ang MNA gihimo sa mga selula sa tumor ug fibroblast sa TME ug gikuha sa mga T cell. Ang MNA nagdugang sa pagbugkos sa Sp1 sa TNFα promoter, nga mosangpot sa pagtaas sa TNFα transcription ug produksiyon sa TNFα cytokine. Ang MNA hinungdan usab sa pagkunhod sa IFN-γ. Ang pagpugong sa function sa T cell mosangpot sa pagkunhod sa abilidad sa pagpatay ug pagpadali sa pagtubo sa tumor.
Sumala sa mga report, ang TNFα adunay front ug back-dependent nga anti-tumor ug anti-tumor nga mga epekto, apan kini adunay nailhan nga papel sa pagpasiugda sa pagtubo ug metastasis sa kanser sa obaryo (31-33). Sumala sa mga report, ang konsentrasyon sa TNFα sa ascites ug mga tisyu sa tumor sa mga pasyente nga adunay kanser sa obaryo mas taas kaysa sa benign nga mga tisyu (34-36). Sa termino sa mekanismo, ang TNFα maka-regulate sa pagpaaktibo, function ug pagdaghan sa mga puti nga selula sa dugo, ug makausab sa phenotype sa mga selula sa kanser (37, 38). Subay niini nga mga nahibal-an, ang differential gene expression analysis nagpakita nga ang TNF miusbaw pag-ayo sa mga T cell sa mga tisyu sa tumor kon itandi sa ascites (Figure 5C). Ang pagtaas sa ekspresyon sa TNF makita lamang sa mga populasyon sa T cell nga adunay non-cytotoxic phenotype (Figure S5A). Sa katingbanan, kini nga datos nagsuporta sa panan-aw nga ang MNA adunay dual immunosuppressive ug tumor promoting effects sa HGSC.
Ang fluorescent labeling nga gibase sa flow cytometry nahimong pangunang pamaagi sa pagtuon sa metabolismo sa TIL. Kini nga mga pagtuon nagpakita nga kon itandi sa peripheral blood lymphocytes o T cells gikan sa secondary lymphoid organs, ang murine ug human TIL adunay mas taas nga tendency sa pagsuhop sa glucose (4, 39) ug ang hinay-hinay nga pagkawala sa mitochondrial function (19, 40). Bisan tuod nakamatikod kami og susamang mga resulta niini nga pagtuon, ang importante nga kalamboan mao ang pagtandi sa metabolismo sa mga tumor cells ug TIL gikan sa parehas nga gikuha nga tumor tissue. Nahiuyon sa pipila niining mga nangaging report, ang mga tumor (CD45-EpCAM +) cells gikan sa ascites ug tumors adunay mas taas nga glucose uptake kaysa CD8 + ug CD4 + T cells, nga nagsuporta nga ang taas nga glucose uptake sa mga tumor cells mahimong itandi sa mga T cells. Ang konsepto sa T cell competition. TME. Bisan pa, ang mitochondrial activity sa mga tumor cells mas taas kaysa sa CD8 + T cells, apan ang mitochondrial activity parehas sa CD4 + T cells. Kini nga mga resulta nagpalig-on sa nag-uswag nga tema nga ang oxidative metabolism importante alang sa mga tumor cells (41, 42). Gisugyot usab nila nga ang mga CD8 + T cell mahimong mas daling maapektuhan sa oxidative dysfunction kaysa sa mga CD4 + T cell, o nga ang mga CD4 + T cell mahimong mogamit ug mga tinubdan sa carbon gawas sa glucose aron mapadayon ang kalihokan sa mitochondrial (43, 44). Kinahanglan nga matikdan nga wala kami nakamatikod ug kalainan sa glucose uptake o mitochondrial activity tali sa mga CD4 + T effector, T effector memory ug T central memory cell sa ascites. Sa susama, ang kahimtang sa pagkalahi sa mga CD8 + T cell sa mga tumor walay kalabotan sa mga pagbag-o sa glucose uptake, nga nagpasiugda sa hinungdanon nga kalainan tali sa mga T cell nga gipatubo sa in vitro ug human TIL in vivo (22). Kini nga mga obserbasyon gikumpirma usab sa paggamit sa unbiased automatic cell population allocation, nga dugang nga nagpadayag nga ang mga CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + cell nga adunay mas taas nga glucose uptake ug mitochondrial activity kaysa mga tumor cell kay kaylap apan adunay Metabolic active cell population. Kini nga populasyon mahimong magrepresentar sa putative subpopulation sa mga myeloid suppressor cell o plasmacytoid dendritic cell nga giila sa scRNA-seq analysis. Bisan tuod kining duha gitaho sa mga tumor sa obaryo sa tawo [45], kinahanglan pa gihapon kini og dugang nga trabaho aron ihulagway kini nga myeloid subpopulation.
Bisan tuod ang mga pamaagi nga gibase sa flow cytometry makapatin-aw sa kinatibuk-ang kalainan sa glucose ug oxidative metabolism tali sa mga tipo sa selula, ang tukma nga mga metabolite nga gihimo sa glucose o uban pang mga tinubdan sa carbon alang sa mitochondrial metabolism sa TME wala pa matino. Ang pag-assign sa presensya o pagkawala sa mga metabolite sa usa ka gihatag nga TIL subset nanginahanglan og pagputli sa populasyon sa selula gikan sa gi-excise nga tisyu. Busa, ang among pamaagi sa pagpayaman sa selula nga giubanan sa mass spectrometry makahatag og mga panabut sa mga metabolite nga lainlain ang pagkadato sa mga T cell ug mga populasyon sa tumor cell sa pagpares sa mga sample sa pasyente. Bisan tuod kini nga pamaagi adunay mga bentaha kaysa fluorescence-activated cell sorting, ang pipila ka mga librarya sa metabolite mahimong maapektuhan tungod sa kinaiyanhong kalig-on ug/o paspas nga turnover rate (22). Bisan pa niana, ang among pamaagi nakahimo sa pag-ila sa duha ka giila nga immunosuppressive metabolites, adenosine ug kynurenine, tungod kay kini managlahi kaayo tali sa mga tipo sa sample.
Ang among metabonomic analysis sa mga tumor ug TIL subtypes naghatag ug dugang nga panabut sa papel sa mga metabolite sa ovarian TME. Una, gamit ang flow cytometry, among natino nga walay kalainan sa mitochondrial activity tali sa mga tumor ug CD4 + T cells. Bisan pa, ang LC-MS/MS analysis nagpadayag ug mga hinungdanon nga pagbag-o sa kadaghan sa mga metabolite taliwala niining mga populasyon, nga nagpakita nga ang mga konklusyon bahin sa metabolismo sa TIL ug sa kinatibuk-ang metabolic activity niini nanginahanglan ug maampingong interpretasyon. Ikaduha, ang MNA mao ang metabolite nga adunay pinakadako nga kalainan tali sa CD45-cells ug T cells sa ascites, dili sa mga tumor. Busa, ang compartmentalization ug lokasyon sa tumor mahimong adunay lainlaing mga epekto sa metabolismo sa TIL, nga nagpasiugda sa posible nga heterogeneity sa usa ka gihatag nga microenvironment. Ikatulo, ang ekspresyon sa MNA-producing enzyme NNMT kasagaran limitado sa CAF, nga mao ang mga tumor cells sa gamay nga sukod, apan ang makita nga lebel sa MNA makita sa mga tumor-derived T cells. Ang overexpression sa NNMT sa ovarian CAF adunay nahibal-an nga epekto sa pagpalambo sa kanser, tungod sa pagpasiugda sa metabolismo sa CAF, pagsulong sa tumor ug metastasis (27). Bisan tuod kasarangan ang kinatibuk-ang lebel sa TIL, ang ekspresyon sa NNMT sa CAF suod nga nalambigit sa Cancer Genome Atlas (TCGA) mesenchymal subtype, nga nalangkit sa dili maayong prognosis (27, 46, 47). Sa katapusan, ang ekspresyon sa enzyme AOX1 nga responsable sa pagkadaot sa MNA limitado usab sa populasyon sa CAF, nga nagpakita nga ang mga T cell kulang sa abilidad sa pag-metabolize sa MNA. Kini nga mga resulta nagsuporta sa ideya nga bisan kung gikinahanglan ang dugang nga trabaho aron mapamatud-an kini nga nakaplagan, ang taas nga lebel sa MNA sa mga T cell mahimong magpakita sa presensya sa usa ka immunosuppressive nga CAF microenvironment.
Tungod sa ubos nga lebel sa ekspresyon sa mga MNA transporter ug sa dili mamatikdan nga lebel sa mga importanteng protina nga nalambigit sa metabolismo sa MNA, ang presensya sa MNA sa mga T cell wala damha. Dili mamatikdan ang NNMT o AOX1 pinaagi sa scRNA-seq analysis ug targeted qPCR sa duha ka independenteng cohort. Kini nga mga resulta nagpakita nga ang MNA wala gi-synthesize sa mga T cell, apan gisuhop gikan sa palibot nga TME. Ang mga in vitro nga eksperimento nagpakita nga ang mga T cell lagmit nga magtipon og exogenous MNA.
Ang among mga in vitro nga pagtuon nagpakita nga ang exogenous MNA nag-induce sa expression sa TNFα sa mga T cell ug nagpalambo sa pagbugkos sa Sp1 sa TNFα promoter. Bisan tuod ang TNFα adunay parehong anti-tumor ug anti-tumor nga mga function, sa kanser sa obaryo, ang TNFα makapalambo sa pagtubo sa kanser sa obaryo (31-33). Ang neutralization sa TNFα sa ovarian tumor cell culture o ang pagwagtang sa TNFα signal sa mga mouse model makapauswag sa TNFα-mediated inflammatory cytokine production ug makapugong sa pagtubo sa tumor (32, 35). Busa, niini nga kaso, ang TME-derived MNA mahimong molihok isip pro-inflammatory metabolite pinaagi sa usa ka TNFα-dependent mechanism pinaagi sa autocrine loop, sa ingon nagpasiugda sa pagtungha ug pagkaylap sa kanser sa obaryo (31). Base niini nga posibilidad, ang TNFα blockade gitun-an isip usa ka potensyal nga therapeutic agent alang sa kanser sa obaryo (37, 48, 49). Dugang pa, ang MNA makadaot sa cytotoxicity sa mga CAR-T cell ngadto sa mga ovarian tumor cell, nga naghatag dugang nga ebidensya alang sa MNA-mediated immune suppression. Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot og usa ka modelo diin ang mga tumor ug mga CAF cell nagpagawas sa MNA ngadto sa extracellular TME. Pinaagi sa (i) TNF-induced ovarian cancer growth stimulation ug (ii) MNA-induced T cell cytotoxic activity inhibition, kini mahimong adunay dual tumor effect (Figure 5D).
Sa konklusyon, pinaagi sa paggamit sa kombinasyon sa paspas nga pagpayaman sa selula, single-cell sequencing ug metabolic profiling, kini nga pagtuon nagpadayag sa dakong immunometabolomic nga mga kalainan tali sa mga tumor ug ascites cells sa mga pasyente sa HGSC. Kini nga komprehensibo nga pag-analisar nagpakita nga adunay mga kalainan sa glucose uptake ug mitochondrial activity tali sa mga T cells, ug giila ang MNA isip usa ka non-cell autonomous immune regulatory metabolite. Kini nga datos adunay epekto kung giunsa makaapekto ang TME sa metabolismo sa T cell sa mga kanser sa tawo. Bisan kung ang direktang kompetisyon alang sa mga sustansya tali sa mga T cells ug mga selula sa kanser gitaho, ang mga metabolite mahimo usab nga molihok isip dili direkta nga mga regulator aron mapalambo ang pag-uswag sa tumor ug posible nga mapugngan ang endogenous immune responses. Ang dugang nga paghulagway sa functional nga papel niining mga regulatory metabolite mahimong magbukas sa alternatibong mga estratehiya alang sa pagpaayo sa anti-tumor immune response.
Ang mga specimen ug klinikal nga datos sa pasyente nakuha pinaagi sa BC cancer tumor tissue repository nga sertipikado sa Canadian Tissue Repository Network. Sumala sa protocol nga giaprobahan sa BC Cancer Research Ethics Committee ug sa University of British Columbia (H07-00463), ang tanang specimen ug klinikal nga datos sa mga pasyente nakakuha og informed written consent o pormal nga giwagtang ang ilang pagtugot. Ang mga sample gitipigan sa sertipikado nga BioBank (BRC-00290). Ang detalyadong mga kinaiya sa pasyente gipakita sa Tables S1 ug S5. Alang sa cryopreservation, gigamit ang scalpel aron mekanikal nga madugta ang sample sa tumor sa pasyente ug dayon iduso kini agi sa 100-micron filter aron makakuha og single cell suspension. Ang ascites sa pasyente gi-centrifuge sa 1500 rpm sulod sa 10 minutos sa 4°C aron i-pellet ang mga selula ug kuhaon ang supernatant. Ang mga selula nga nakuha gikan sa tumor ug ascites gi-cryopreserve sa 50% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ug 10% dimethyl sulfoxide. Kini nga mga napreserbar nga single cell suspensions gitunaw ug gigamit alang sa metabolomics ug metabolite determination nga gihulagway sa ubos.
Ang kompletong medium gilangkoban sa 0.22 μm nga gisala 50:50 nga gidugangan sa RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) nga gidugangan og 10% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) solution (Thermo Fisher Scientific) ug 50 μMB-mercaptoethanol. Ang AimV (Invitrogen) gidugangan og 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ug 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Ang flow cytometer staining buffer gilangkoban sa 0.22μm filtered phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) nga gidugangan og 3% heat-inactivated AB human serum (Sigma). Ang cell enrichment buffer gilangkoban sa 0.22μm nga sinala nga PBS ug gisuplementohan og 0.5% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich).
Sa 37°C nga kompletong medium, ang mga selula gi-stain gamit ang 10 nM MT DR ug 100 μM 2-NBDG sulod sa 30 minutos. Sunod, ang mga selula gi-stain gamit ang viability dye eF506 sa 4°C sulod sa 15 minutos. I-suspend pag-usab ang mga selula sa FC Block (eBioscience) ug Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), tunawon sa flow cytometer staining buffer (sumala sa instruksyon sa tiggama), ug i-incubate sulod sa 10 minutos sa temperatura sa kwarto. I-stain ang mga selula gamit ang usa ka set sa mga antibodies (Table S2) sa flow cytometry staining buffer sa 4°C sulod sa 20 minutos. I-suspend pag-usab ang mga selula sa flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) sa dili pa ang pag-analisa. Gamita ang SpectroFlo ug FlowJo V10 aron pag-analisa sa datos sa ihap sa selula, ug gamita ang GraphPad Prism 8 aron paghimo sa datos. Ang median fluorescence intensity (MFI) sa 2-NBDG ug MT DR gi-log-normalize, ug dayon gigamit ang paired t test para sa statistical analysis aron ma-account ang mga matched nga pasyente. Kuhaa ang tanang populasyon nga adunay ubos sa 40 ka events gikan sa analysis; isulod ang MFI value nga 1 para sa bisan unsang negatibong values ​​sa dili pa mohimo og statistical analysis ug data visualization.
Aron madugangan ang manual gating strategy sa nahisgutang process panel, among gigamit ang tibuok annotation sa shape restriction tree (FAUST) (21) aron awtomatikong i-assign ang mga cells sa populasyon human matangtang ang mga patay nga cells sa FlowJo. Among mano-manong gidumala ang output aron i-merge ang mga populasyon nga daw wala gi-misalocate (gihiusa ang PD1+ uban sa PD1-tumor cells) ug ang mga gi-retain nga populasyon. Ang matag sample adunay aberids nga sobra sa 2% nga mga cells, para sa total nga 11 ka populasyon.
Gigamit ang Ficoll gradient density centrifugation aron ibulag ang PBMC gikan sa mga produkto sa pagbulag sa leukocyte (STEMCELL Technologies). Ang mga CD8 + T cell gi-isolate gikan sa PBMC gamit ang CD8 MicroBeads (Miltenyi) ug gipalapdan sa kompletong medium gamit ang TransAct (Miltenyi) sulod sa 2 ka semana sumala sa instruksyon sa tiggama. Ang mga selula gitugotan nga mobarog sulod sa 5 ka adlaw sa kompletong medium nga adunay IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ug dayon gi-stimulate pag-usab gamit ang TransAct. Sa ika-7 nga adlaw, sumala sa instruksyon sa tiggama, ang human CD45 MicroBeads (Miltenyi) gigamit aron pauswagon ang mga selula sa tulo ka sunod-sunod nga hugna. Ang mga selula gi-aliquote alang sa flow cytometry analysis (sama sa gihulagway sa ibabaw), ug usa ka milyon nga mga selula ang gi-aliquote sa tulo ka beses alang sa LC-MS/MS analysis. Ang mga sample giproseso pinaagi sa LC-MS/MS sama sa gihulagway sa ubos. Among gibanabana ang nawala nga metabolite value nga adunay ion number nga 1,000. Ang matag sample gi-normalize sa total ion number (TIC), gi-logarithmically convert ug awtomatikong gi-normalize sa MetaboAnalystR sa dili pa ang pag-analisa.
Ang single cell suspension sa matag pasyente gitunaw ug gisala pinaagi sa 40 μm filter ngadto sa kompletong medium (sama sa gihulagway sa ibabaw). Sumala sa protocol sa tiggama, tulo ka sunod-sunod nga hugna sa positibo nga pagpili pinaagi sa magnetic bead separation gamit ang MicroBeads (Miltenyi) ang gigamit aron mapayaman ang mga sample para sa mga CD8+, CD4+ ug CD45- cells (sa yelo). Sa laktod nga pagkasulti, ang mga cell gisuspende pag-usab sa cell enrichment buffer (sama sa gihulagway sa ibabaw) ug giihap. Ang mga cell gi-incubate sa human CD8 beads, human CD4 beads o human CD45 beads (Miltenyi) sa 4°C sulod sa 15 minutos, ug dayon gihugasan gamit ang cell enrichment buffer. Ang sample gipaagi sa LS column (Miltenyi), ug ang positibo ug negatibo nga mga fraction gikolekta. Aron maminusan ang gidugayon ug mapadako ang lakang sa pagbawi sa cell, ang CD8-fraction gigamit dayon alang sa ikaduhang hugna sa CD4+ enrichment, ug ang CD4-fraction gigamit alang sa sunod nga CD45-enrichment. Ipadayon ang solusyon sa yelo sa tibuok proseso sa pagbulag.
Aron maandam ang mga sample para sa metabolite analysis, ang mga selula gihugasan kausa gamit ang bugnaw nga solusyon sa asin, ug 1 ml nga 80% methanol ang gidugang sa matag sample, dayon gi-vortex ug gi-snap frozen sa liquid nitrogen. Ang mga sample gipailalom sa tulo ka freeze-thaw cycle ug gi-centrifuge sa 14,000 rpm sulod sa 15 minutos sa 4°C. Ang supernatant nga adunay mga metabolite gipaalisngaw hangtod nga mamala. Ang mga metabolite gitunaw pag-usab sa 50 μl nga 0.03% formic acid, gi-vortex aron isagol, ug dayon gi-centrifuge aron makuha ang mga hugaw.
Kuhaa ang mga metabolite sama sa gihulagway sa ibabaw. Ibalhin ang supernatant ngadto sa usa ka high performance liquid chromatography nga botelya para sa metabolomics research. Gamita ang random treatment protocol aron matambalan ang matag sample gamit ang parehas nga gidaghanon sa mga cells aron malikayan ang batch effects. Naghimo kami og qualitative assessment sa mga global metabolite nga kaniadto gipatik sa AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Ang chromatographic analysis ug peak area integration gihimo gamit ang MultiQuant version 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
Usa ka ion count nga 1000 ang gigamit aron mabanabana ang nawala nga metabolite value, ug ang TIC sa matag sample gigamit aron makalkulo ang normalized peak area sa matag nakita nga metabolite aron matul-id ang mga pagbag-o nga gihimo sa instrumental analysis gikan sa sample processing. Human ma-normalize ang TIC, ang MetaboAnalystR(51) (default parameter) gigamit alang sa logarithmic conversion ug automatic norm line scaling. Gigamit namo ang PCA nga adunay vegan R package aron paghimo og exploratory analysis sa mga kalainan sa metabolome tali sa mga tipo sa sample, ug gigamit ang partial redundancy analysis aron pag-analisa sa mga pasyente. Gamita ang Ward method aron paghimo og heat map dendrogram aron ma-cluster ang Euclidean distance tali sa mga sample. Gigamit namo ang limma (52) sa standardized metabolite abundance aron mailhan ang differentially abundant metabolites sa tibuok cell type ug microenvironment. Aron mapasayon ​​ang pagpasabot, gigamit namo ang group mean parameter aron ipiho ang modelo, ug gikonsiderar ang mga tipo sa cell sa microenvironment isip matag grupo (n = 6 ka grupo); para sa significance test, naghimo kami og tulo ka balik-balik nga pagsukod alang sa matag metabolite Aron malikayan ang sayop nga replication, ang pasyente gilakip isip babag sa limma design. Aron masusi ang mga kalainan sa mga metabolite tali sa lainlaing mga pasyente, among gi-adjust ang limma model lakip ang mga pasyente sa usa ka piho nga paagi. Gireport namo ang kamahinungdanon sa pre-specified contrast tali sa cell type ug sa microenvironment sa Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction).
Human sa pagpausbaw sa kusog gamit ang Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% nga viability), gihimo ang single-cell transcriptome sequencing sa kinatibuk-ang live frozen ascites ug tumor samples gamit ang 10x 5′gene expression protocol. Lima ka kaso nga adunay parehas nga tumor ug ascites ang gisusi, bisan kung ang ubos nga viability gikan sa usa ka tumor sample nakapugong sa paglakip niini. Aron makab-ot ang daghang mga pagpili sa mga pasyente, among gihiusa ang mga sample sa matag pasyente sa mga lane sa 10x chromium controller, ug gisusi ang mga ascites ug mga site sa tumor nga gilain. Human sa sequencing [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; usa ka aberids nga 73,488 ug 41,378 nga pagbasa matag selula para sa tumor ug ascites matag usa]], among gigamit ang CellSNP ug Vireo (53) (base sa CellSNP isip Ang komon nga human SNP (VCF) nga gihatag sa GRCh38 gi-assignan og donor identity. Gigamit namo ang SNPRelate aron mahibal-an ang pinakaduol nga identity (IBS) sa genotype status (IBS) sa pasyente, wala gilakip ang wala ma-assign nga mga selula ug mga selula nga giila nga duplexes ug ang pagpares sa mga donor tali sa ascites ug mga sample sa tumor (54). Base niini nga buluhaton, among gipadayon ang tulo ka mga kaso nga adunay daghang representasyon sa selula sa tumor ug ascites para sa downstream analysis. Human sa paghimo sa usa ka mass filtration step sa scater (55) ug scran (56) BioConductor packaging, kini nakahatag og 6975 ka mga selula (2792 ug 4183 ka mga selula gikan sa tumor ug ascites, matag usa) para sa analysis. Gigamit namo ang igraph's (57) Louvain clustering sa shared nearest neighbor network (SNN) base sa Jaccard distance ngadto sa cluster cells pinaagi sa expression. Ang mga cluster gi-annotate sa mano-mano sa gituohang mga tipo sa cell base sa marker gene expression ug gi-visualize gamit ang t-SNE. Ang mga cytotoxic T cell gihubit pinaagi sa expression sa CD8A ug GZMA, wala gilakip ang mga subcluster nga adunay ubos nga ribosomal protein expression. Among gi-access ang gipatik nga datos ni Izar et al. (16), lakip ang ilang t-SNE embedding, nga makakontrol sa expression overlap tali sa immune cell markers ug NNMT expression.
Ang mga PBMC gibulag gikan sa mga produkto sa pagbulag sa leukocyte (STEMCELL Technologies) pinaagi sa Ficoll gradient density centrifugation. Ang mga CD3 + nga selula gibulag gikan sa PBMC gamit ang mga CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya o kawalay MNA, ang mga CD3+ nga selula gi-activate gamit ang plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) ug IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Sa katapusang adlaw sa pagpalapad, ang viability (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ug proliferation (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) gisusi pinaagi sa flow cytometry. Susiha ang function sa effector pinaagi sa pag-stimulate sa mga selula gamit ang PMA (20 ng/ml) ug ionomycin (1μg/ml) gamit ang GolgiStop sulod sa 4 ka oras, ug monitora ang CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ug TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). I-stimulate ang qPCR ug ChIP cells gamit ang PMA (20 ng/ml) ug ionomycin (1μg/ml) sulod sa 4 ka oras. Ang ELISA supernatant gikolekta sa wala pa ug pagkahuman sa stimulation gamit ang PMA (20 ng/ml) ug ionomycin (1 μg/ml) sulod sa 4 ka oras.
Sunda ang protocol sa tiggama aron i-isolate ang RNA gamit ang RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gamita ang QIAshredder (QIAGEN) aron i-homogenize ang sample. Gamita ang high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) aron i-synthesize ang complementary DNA (cDNA). Gamita ang TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) aron masukod ang gene expression (sumala sa protocol sa tiggama) gamit ang mosunod nga mga probe: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] ug Hs01010726_m1 (SLC22A2). Ang mga sample gipadagan sa StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) sa MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) nga adunay MicroAmp optical film. Ang bisan unsang Ct value nga molapas sa 35 giisip nga labaw sa detection threshold ug gimarkahan nga dili mamatikdan.
Buhata ang ChIP sama sa gihulagway kaniadto (58). Sa laktod nga pagkasulti, ang mga selula gitambalan gamit ang formaldehyde (katapusang konsentrasyon nga 1.42%) ug gi-incubate sa temperatura sa kwarto sulod sa 10 ka minuto. Gamita ang supplemented swelling buffer (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ug 0.1% NP-40) sa yelo sulod sa 10 ka minuto, dayon i-resuspend sa immunoprecipitation buffer sama sa gihulagway (58). Ang sample gi-sonicate dayon gamit ang mosunod nga mga siklo: 10 ka siklo (20 ka 1-segundo nga pulso) ug usa ka static nga oras nga 40 segundos. I-incubate ang ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ug SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) nga mga antibody uban ang sample sa 4°CC shake overnight. I-incubate ang protein A beads (Thermo Fisher Scientific) gamit ang sample sa 4°C nga hinayhinay nga giuyog sulod sa 1 ka oras, dayon gamita ang chelex beads (Bio-Rad) aron mapayaman ang DNA, ug gamita ang proteinase K (Thermo Fisher) para sa paghilis sa protina. Ang TNFα promoter nakita pinaagi sa PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sa sukwahi, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp nga produkto). Ang mga imahe gihimo sa Image Lab (Bio-Rad) ug gi-quantify gamit ang ImageJ software.
Ang cell culture supernatant gikolekta sama sa gihulagway sa ibabaw. Ang pagtino gihimo sumala sa mga pamaagi sa tiggama sama sa human TNFα ELISA kit (Invitrogen), human IL-2 ELISA kit (Invitrogen) ug human IFN-γ ELISA kit (Abcam). Sumala sa protocol sa tiggama, ang supernatant gi-dilute og 1:100 aron makit-an ang TNFα ug IL-2, ug 1:3 aron makit-an ang IFN-γ. Gamita ang EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) aron masukod ang absorbance sa 450 nm.
Ang mga PBMC gibulag gikan sa mga produkto sa pagbulag sa leukocyte (STEMCELL Technologies) pinaagi sa Ficoll gradient density centrifugation. Ang mga CD3 + nga selula gi-isolate gikan sa PBMC gamit ang CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya o kawalay MNA, ang mga CD3+ nga selula gi-activate gamit ang plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) ug IL-2 (300 U/ml; Proleukin) sulod sa 3 ka adlaw. Pagkahuman sa 3 ka adlaw, ang mga selula gikolekta ug gihugasan gamit ang 0.9% saline, ug ang pellet gi-snap frozen. Ang pag-ihap sa selula gihimo pinaagi sa flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) gamit ang 123count eBeads.
Kuhaa ang mga metabolite sama sa gihulagway sa ibabaw. Ang uga nga kinuha gi-reconstitute sa konsentrasyon nga 4000 cell equivalents/μl. Analisaha ang sample pinaagi sa reversed-phase chromatography (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ug CORTECS T3 column (2.1×150 mm, particle size 1.6-μm, pore size 120-Å; #186008500, Waters). Polar mass spectrometer (6470, Agilent), diin ang electrospray ionization naglihok sa positive mode. Ang mobile phase A kay 0.1% formic acid (sa H2O), ang mobile phase B kay 90% acetonitrile, 0.1% formic acid. Ang LC gradient kay 0 ngadto sa 2 ka minuto para sa 100% A, 2 ngadto sa 7.1 ka minuto para sa 99% B, ug 7.1 ngadto sa 8 ka minuto para sa 99% B. Dayon i-equilibrate pag-usab ang column gamit ang mobile phase A sa flow rate nga 0.6 ml/min sulod sa 3 ka minuto. . Ang flow rate kay 0.4ml/min, ug ang column chamber ipainit ngadto sa 50°C. Gamita ang pure chemical standard sa MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) aron ma-establisar ang retention time (RT) ug transformation (RT = 0.882 ka minuto, transformation 1 = 137→94.1, transformation 2 = 137→92, Conversion 3 = 137→78). Kung ang tanang tulo ka transition mahitabo sa saktong retention time, ang transition 1 gamiton para sa quantification aron masiguro ang specificity. Ang standard curve sa MNA (Toronto Research Chemical Company) gihimo pinaagi sa unom ka serial dilutions sa stock solution (1 mg/ml) aron makakuha og mga standard nga 0.1, 1.0, 10 ug 100 ng/ml ug 1.0 ug 10μg/ml matag usa nga likido. Ang detection limit kay 1 ng/ml, ug ang linear response kay tali sa 10 ng/ml ug 10μg/ml. Ang matag injection sa duha ka microliters sa sample ug standard gigamit para sa LC/MS analysis, ug ang mixed quality control sample gihimo matag walo ka injection aron masiguro ang kalig-on sa analysis platform. Ang MNA responses sa tanang MNA-treated cell samples naa sa sulod sa linear range sa assay. Ang data analysis gihimo gamit ang MassHunter quantitative analysis software (v9.0, Agilent).
Ang ikaduhang henerasyon nga αFR-CAR construct gikuha gikan ni Song et al. (59). Sa laktod nga pagkasulti, ang construct naglangkob sa mosunod nga mga sulod: CD8a leader sequence, human αFR-specific single-chain variable fragment, CD8a hinge ug transmembrane region, CD27 intracellular domain ug CD3z intracellular domain. Ang kompletong CAR sequence gi-synthesize sa GenScript, ug dayon gi-clone ngadto sa ikaduhang henerasyon nga lentiviral expression vector upstream sa GFP expression cassette nga gigamit sa pag-evaluate sa transduction efficiency.
Ang Lentivirus gihimo pinaagi sa transfection sa HEK293T cells [American Type Culture Collection (ATCC); gipatubo sa Dulbecco's modified Eagle medium nga adunay 10% fetal bovine serum (FBS) ug 1% PenStrep, ug gigamit ang CAR-GFP vector ug ang packaging plasmids (psPAX2 ug pMD2.G, Addgene) naggamit og lipofection amine (Sigma-Aldrich). Ang supernatant nga adunay virus gikolekta 48 ug 72 ka oras human sa transfection, gisala, ug gikonsentrar pinaagi sa ultracentrifugation. Tipigi ang concentrated viral supernatant sa -80°C hangtod sa transduction.
Ang mga PBMC gibulag gikan sa himsog nga donor leukocyte separation products (STEMCELL Technologies) pinaagi sa Ficoll gradient density centrifugation. Gamita ang positive selection CD8 microbeads (Miltenyi) aron ibulag ang mga CD8+ cells gikan sa PBMC. Pasiglaha ang mga T cells gamit ang TransAct (Miltenyi) ug sa TexMACS medium [Miltenyi; gidugangan og 3% heat-inactivated human serum, 1% PenStrep ug IL-2 (300 U/ml)]. Baynte kwatro ka oras human sa stimulation, ang mga T cells gi-transduce gamit ang lentivirus (10 μl concentrated virus supernatant kada 106 ka cells). 1 ngadto sa 3 ka adlaw human sa transduction sa Cytek Aurora (sa FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), susiha ang GFP expression sa mga cells aron ipakita ang transduction efficiency nga labing menos 30%.
Ang mga CAR-T cell gi-culture sulod sa 24 oras sa Immunocult (STEMCELL Technologies; gidugangan og 1% PenStrep) ubos sa mosunod nga mga kondisyon: wala matambalan, gitambalan og 250 μM adenosine o 10 mM MNA. Human sa pretreatment, ang mga CAR-T cell gihugasan gamit ang PBS ug gihiusa sa 20,000 ka SK-OV-3 cells [ATCC; sa McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) nga gidugangan og 10% FBS ug 1% PenStrep sa 10: Ang effector ngadto sa target ratio nga 1 gi-amplify sa triplicate sa gidugangan nga Immunocult medium. Ang mga SK-OV-3 cells ug SK-OV-3 cells nga gi-lyse gamit ang digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) gigamit isip negatibo ug positibo nga mga kontrol, matag usa. Human sa 24 oras nga co-cultivation, ang supernatant gikolekta ug ang lactate dehydrogenase (LDH) gisukod sumala sa instruksyon sa tiggama (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Ang LDH supernatant gi-dilute og 1:50 sa LDH buffer. Ang porsyento sa pagpatay gisukod gamit ang mosunod nga pormula: porsyento sa pagpatay = porsyento sa koreksyon / maximum killing rate x 100%, diin ang porsyento sa koreksyon = co-culture-T cells lamang, ug ang maximum killing rate = positive control-negative control.
Sama sa gihulagway sa teksto o mga materyales ug pamaagi, gamita ang GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 para sa statistical analysis. Kung daghang sample ang nakolekta gikan sa parehas nga pasyente (sama sa ascites ug tumor), mogamit kami og paired t test o ilakip ang pasyente isip random effect sa usa ka linear o generalized model kung angay. Para sa metabolomics analysis, ang importance test gihimo sa triplicate.
Para sa dugang nga mga materyales para niining artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Kini usa ka open access nga artikulo nga giapod-apod ubos sa mga termino sa Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike License, nga nagtugot sa paggamit, pag-apod-apod, ug pagpatik pag-usab sa bisan unsang medium, basta ang katapusang paggamit dili alang sa komersyal nga ganansya ug ang premise mao nga ang orihinal nga buhat husto. Reperensya.
Pahinumdom: Among gihangyo lang nga ihatag nimo ang imong email address aron ang tawo nga imong girekomenda sa panid mahibalo nga gusto nimo nga makita nila ang email ug nga dili kini spam. Dili kami mokuha og bisan unsang email address.
Kini nga pangutana gigamit aron pagsulay kung ikaw usa ka bisita ug mapugngan ang awtomatikong pagsumite sa spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ang MNA nakatampo sa pagpugong sa resistensya sa mga T cell ug nagrepresentar sa usa ka potensyal nga target sa immunotherapy alang sa pagtambal sa kanser sa tawo.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ang MNA nakatampo sa pagpugong sa resistensya sa mga T cell ug nagrepresentar sa usa ka potensyal nga target sa immunotherapy alang sa pagtambal sa kanser sa tawo.
©2021 American Association for the Advancement of Science. ang tanan nga mga katungod gigahin. Ang AAAS kauban sa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ug COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.