Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta para sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Dili sama sa mga vertebrate, ang mga insekto gituohan nga walay mga sex steroid hormone nga gipihig sa lalaki. Sa Anopheles gambiae, ang ecdysone steroid nga 20-hydroxyecdysone (20E) daw mi-evolve aron makontrol ang paglambo sa itlog kung gi-synthesize sa mga babaye2 ug aron ma-induce ang usa ka mating refractory period kung gibalhin sa sekswal nga paagi sa mga lalaki3. Tungod kay ang paglambo sa itlog ug pagminyo mga importanteng kinaiya sa pagsanay, ang pagsabot kung giunsa pag-integrate sa mga babaye nga lamok nga Anopheles kini nga mga hormonal signal mahimong makapadali sa pagdesinyo sa bag-ong mga programa sa pagkontrol sa malaria. Dinhi, among gipadayag nga kini nga mga gimbuhaton sa pagsanay gi-regulate sa lahi nga mga sex steroid pinaagi sa usa ka komplikado nga network sa mga enzyme nga nagpa-aktibo/nagpa-aktibo sa ecdysteroid. Among giila ang usa ka male-specific oxidized ecdysone, 3-dehydro-20E (3D20E), nga nanalipod sa ginikanan pinaagi sa pagpahunong sa pagdawat sa sekswal sa babaye pagkahuman sa pagbalhin sa sekswal ug pagpaaktibo pinaagi sa dephosphorylation. Talalupangdon, ang pagbalhin sa 3D20E nag-induce usab sa ekspresyon sa mga gene sa pagsanay nga nagmintinar sa paglambo sa itlog sa panahon sa impeksyon sa Plasmodium, nga nagsiguro sa kahimsog sa mga nataptan nga babaye. Ang 20E nga nakuha gikan sa babaye wala magpahinabog sekswal nga epekto. tubag, apan nagtugot sa mga indibidwal nga nag-ipon nga mangitlog human mapugngan ang 20E-inhibiting kinases. Ang pag-ila niining male-specific insect steroid hormone ug ang papel niini sa pag-regulate sa babaye nga sekswal nga pagdawat, pertilidad ug interaksyon sa Plasmodium nagsugyot sa potensyal nga pagpakunhod sa kalampusan sa reproduktibo sa mga lamok nga nagpasa sa malaria.
Nagkataas na usab ang mga kaso sa malaria ug mga kamatayon4 tungod sa kaylap nga resistensya sa mga lamok nga Anopheles sa insecticide, ang bugtong tigdala sa mga parasito sa malaria sa tawo. Ang biology sa pag-asawa niining mga lamok usa ka madanihon nga target alang sa bag-ong mga interbensyon sa pagkontrol sa malaria tungod kay ang mga babaye kausa ra mag-asawa5; ang paghimo niining usa ka panghitabo sa pag-asawa nga sterile adunay dako nga potensyal sa pagpakunhod sa populasyon sa lamok sa uma.
Ang mga babaye mahimong dili makahimo sa sekso human makadawat og taas nga titer nga steroid hormones gikan sa mga lalaki. Gipakita sa mga pagtuon nga ang hinungdan sa kalisud sa dugang nga pagminyo mao ang 20-hydroxyecdysone (20E), usa ka steroid hormone nga mas nailhan nga regulator sa molting cycle sa larval stage. Ang abilidad sa mga lalaki sa pag-synthesize ug pagbalhin sa 20E naugmad ilabi na sa mga espisye sa Anopheles nga kabahin sa subgenus Cellia7, nga mikaylap sa Africa ug naglakip sa labing delikado nga mga vector sa malaria, lakip ang Anopheles gambiae. Kini labi ka talagsaon tungod kay niining mga espisye ang mga babaye naghimo usab og 20E pagkahuman sa matag pagkaon sa dugo, ug ang 20E nagduso sa oogenesis cycle (tan-awa ang ref. 8). Bisan pa, gamay ra ang nahibal-an bahin sa paagi diin ang mga babaye nag-integrate sa mga signal gikan sa duha ka lainlaing gigikanan sa ecdysone (pagbalhin sa lalaki ug pag-induction sa pagpakaon sa dugo) nga wala gikompromiso ang ilang kaugalingon nga abilidad sa pagminyo. Sa tinuud, kung ang 20E nga gihimo sa mga babaye hinungdan sa pagkadili-matugot sa sekso, kini mosangpot sa pagkabaog sa mga indibidwal nga nagpasuso sa mga birhen, usa ka kasagaran nga pamatasan niining mga lamok5.
Usa ka posibleng katin-awan mao nga ang mga laki nga A. gambiae nagbalhin og giusab nga ecdysone nga espesipiko sa lalaki, nga nagpaaktibo sa usa ka signaling cascade sa reproductive tract sa babaye, nga miresulta sa kawalay kalig-on sa pagminyo. Bisan pa, bisan kung ang mga vertebrate adunay daghang mga hormone sa steroid, sama sa estrogen ug androgen (gisusi sa ref. 9), sa among nahibal-an, ang mga steroid nga biased sa androgenic wala pa mailhi sa mga insekto.
Among gitinguha nga mahibal-an ang repertoire sa mga steroid hormone sa male male accessory gland (MAG) sa sexually mature nga A. gambiae aron mangita og posibleng modifying steroids. Gamit ang high performance liquid chromatography inubanan sa tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) imbes sa dili kaayo espesipikong pamaagi nga gigamit kaniadto, among nakita ang ecdysone (E) ug 20E niini nga tisyu, nga nagpamatuod sa miaging resulta. Bisan pa, ang sample gidominar sa oxidized phosphorylated steroids, nga nahiuyon sa pormula nga 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Figure 1). Ang ubang mga porma naglakip sa 3-dehydro-20E (3D20E) ug 20E-22-phosphate (20E22P). Ang HPLC-MS/MS signal intensity sa 3D20E22P duha ka order sa magnitude nga mas taas kaysa sa dephosphorylated form niini, 3D20E, ug tulo ka order sa magnitude nga mas taas kaysa sa E ug 20E (Figure 1). Bisan kung sa ubang mga bahin sa lawas ug ang ubos nga reproductive tract (LRT; Extended Data Fig. 1a). Gisusi usab namo ang mga ecdysteroid sa bag-ong sirado (<1 ka adlaw ang edad) nga mga lalaki ug babaye ug nakit-an ang 3D20E ug 3D20E22P lamang sa MAG; Ang E, 20E ug 20E22P anaa sa duha ka sekso (Extended Data Fig. 1b). Kini nga datos nagsugyot nga ang mga hamtong nga lalaki nga A. gambiae nagpatunghag taas nga titers sa modifying hormones sa ilang mga MAG nga wala gi-synthesize sa mga babaye.
Ang MAG ug babaye nga LRT (lakip ang atria, seminal vesicles, ug parovarium) gi-dissect gikan sa 4 ka adlaw nga edad (4 ka adlaw nga edad) nga birhen nga mga lalaki ug birhen ug gipares nga mga babaye (0.5, 3, ug 12 hpm). Ang Ecdysone niining mga tisyu gi-analisa pinaagi sa HPLC-MS/MS (mean ± sem; unpaired t-test, two-sided, false discovery rate (FDR) corrected; NS, not significant; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 ka oras vs. 0.5 ka oras, P = 0.035; 12 ka oras vs. 3 ka oras, P = 0.0015; 12 ka oras vs. 0.5 ka oras, P = 0.030. 3D20E22P: 3 ka oras vs. 0.5 ka oras, P = 0.25; 12 ka oras vs. 3 ka oras, P = 0.0032; 12 ka oras vs. 0.5 ka oras, P = 0.015). Ang datos gikan sa tulo ka biological replicates. Ang peak area para sa matag ecdysone nga gikonsiderar gikalkulo ug gi-normalize sa gidaghanon sa mga lamok. Ang Ecdysone girepresentahan sa kolor sama sa mosunod: E, berde; 20E, orange; 20E22P, purpura; 3D20E, asul; 3D20E22P, pink. Ang inset nagdugang sa sukod sa y-axis aron ipakita ang mas ubos nga lebel sa ecdysone.
Aron imbestigahan kung ang 3D20E22P ug 3D20E nabalhin ba atol sa pag-mating, among gi-dissect ang mga babayeng LRT sa lain-laing mga punto sa oras human sa pag-mating. Bisan tuod ang ecdysone wala makit-i sa mga birhen, among naobserbahan ang dakong kantidad sa 3D20E22P sa LRT human dayon sa pag-mating (0.5 ka oras human sa pag-mating, hpm), nga mikunhod sa paglabay sa panahon, samtang ang lebel sa 3D20E misaka pag-ayo (Fig. 1). Gamit ang kemikal nga gi-synthesize nga 3D20E isip sukdanan, among natino nga ang lebel niining steroid hormone sa mga LRT nga nag-mating labing menos 100 ka pilo nga mas taas kay sa 20E (Extended Data Table 1). Busa, ang 3D20E22P mao ang pangunang lalaki nga ecdysone nga nabalhin ngadto sa babayeng LRT atol sa pag-mating, ug ang dephosphorylated nga porma niini, ang 3D20E, nahimong daghan kaayo human dayon sa pag-mating. Kini nagsugyot og importante nga papel alang sa ulahi nga ecdysone sa biology sa babaye human sa pag-mating.
Human sa paghimo og bag-ong RNA sequencing (RNA-seq) dataset (Fig. 2a), gamit ang custom-built bioinformatics pipeline, nangita mi og ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ug ecdysone encoding 20E-modified phosphatase gene. Ang EPP) gipahayag sa mga tisyu sa reproduktibo. Nakaila mi og usa ka kandidato nga EPP gene ug duha ka potensyal nga EcK genes (EcK1 ug EcK2), apan wala mi makakita og maayong kandidato nga EO gene. Ilabi na, ang indibidwal nga mga gene sa EPP gipahayag sa taas nga lebel (98.9th percentile) sa Gambian MAGs apan dili sa babaye nga LRTs (Fig. 2b), sukwahi sa among gilauman tungod kay ang dephosphorylation sa 3D20E22P nahitabo niining babaye nga tisyu. Busa, nagtuo kami nga ang lalaki nga EPP mahimong mabalhin atol sa pag-mating. Sa tinuud, migamit kami og in vivo stable isotope labeling aron matabonan ang babaye nga protina human sa pag-mating, usa ka enzyme nga giila sa MS sa babaye nga atrium (Fig. 2c ug Supplementary Table 1). Ang presensya sa Ang EPP sa MAG ug ang gipares (apan dili birhen) nga babaye nga LRT gikumpirma usab gamit ang piho nga mga antibody (Fig. 2d).
a, Usa ka gipahaom nga bioinformatics pipeline aron mangita sa mga tisyu sa reproduktibo sa matag sekso alang sa mga gene nga nag-encode sa EcKs, EOs, ug EPPs. Ang mga numero tupad sa mga pana nagpakita sa gidaghanon sa mga kandidato nga lalaki ug babaye sa matag lakang. Kini nga pag-analisar nag-ila sa usa ka EPP gene (EPP) ug usa ka EcK gene (EcK1) nga gipahayag sa mga lalaki, ug usa ka EcK gene (EcK2) nga gipahayag sa duha ka sekso apan wala maghatag og kandidato nga EO gene. b, Heatmap nga nagtandi sa ekspresyon sa kandidato nga gene sa mga tisyu sa virgin (V) ug mating (M) nga Anopheles gambiae ug Anopheles albicans. Spca, fertilization; MAGs, accessory glands sa mga lalaki; ubang mga parte sa lawas, lakip ang mga dughan, pako, bitiis, tambok nga mga lawas, ug mga internal nga organo sa duha ka sekso, ug mga obaryo sa mga babaye. Ang EcK2 taas og ekspresyon sa MAG ug atria sa Gambia, samtang ang EPP makita lamang sa MAG.c, Proteomic analysis sa male ejaculate group translocation ngadto sa female atria sa 3, 12 ug 24 hpm, nga nagpakita sa 67 ka pinakadaghang protina. Ang mga babaye gipadako sa usa ka diyeta nga adunay 15N aron markahan (ug takpan) ang tanan nga mga protina. Ang mga lalaki nga wala gi-tag gipares sa mga babaye nga adunay tag, ug ang mga babaye nga LRT gi-dissect sa 3, 12 ug 24 hpm para sa proteomic analysis (tan-awa ang Supplementary Table 1 para sa kompletong listahan sa mga ejaculatory protein). Inset, ang EPP, Eck1 ug EcK2 nakita sa MAG sa mga birhen nga lalaki pinaagi sa proteomic analysis niining mga tisyu.d, ang EPP nakita pinaagi sa western blot sa MAG ug LRT sa mga babaye nga gipares, apan dili sa mga birhen nga babaye o mga lalaki o sa nahabilin nga bahin sa lawas sa babaye. Ang mga lamad dungan nga gisusi gamit ang anti-actin (loading control) ug anti-EPP antibodies. Ang tanang lalaki mga birhen. Tan-awa ang Supplementary Figure 1 para sa gel source data. Ang Western blots gihimo kaduha nga adunay parehas nga mga resulta.
Ang kalihokan sa ecdysteroid phosphophosphatase sa EPP napamatud-an human sa incubation pinaagi sa HPLC-MS/MS gamit ang 3D20E22P nga gi-isolate gikan sa MAG (Extended Data Fig. 2a). Dugang pa, sa dihang among gipahilom ang EPP pinaagi sa RNA-mediated interference (RNAi), among nakita ang kusog nga pagkunhod sa kalihokan sa phosphatase sa mga tisyu sa pagsanay niining mga lalaki (Fig. 3a), ug ang mga babaye nga gipares sa mga lalaki nga gipahilom sa EPP nagpakita og dakong ubos nga proporsyon sa dephosphorylated 3D20E (Fig. 3b) bisan pa sa partial gene silencing (Extended Data Fig. 2b,c). Sa kasukwahi, wala kami nakakita og dakong mga pagbag-o sa ratio sa 20E22P/20E sa samang mga lamok, nga mahimong nagsugyot nga ang enzyme espesipiko alang sa 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Mikunhod nga kalihokan sa phosphatase sa MAG nga gipahinabo sa pagpahilom sa EPP gamit ang double-stranded EPP RNA (dsEPP) o double-stranded GFP RNA (dsGFP) nga mga kontrol. Baynte ka MAG pool ang gigamit sa matag replicate (P = 0.0046, paired t-test, two-sided), nga girepresentahan sa managlahing tuldok. b, Ang mga babaye nga gipares sa mga lalaki nga gipahilom sa EPP adunay mas ubos nga proporsyon sa dephosphorylated 3D20E sa 3 hpm (P = 0.0043, unpaired t-test, two-sided), samtang ang lebel sa 20E wala maapektuhan (P = 0.063, unpaired). t-test, duha ka kilid). Ang datos gipresentar isip mean ± sem gikan sa tulo ka pool nga 13, 16 ug 19 ka babaye matag usa.c, Ang mga babaye nga gipares sa mga lalaki nga gi-silence sa EPP adunay mas taas nga rate sa re-mating (P = 0.0002, Fisher's exact test, duha ka kilid). Ang mga babaye unang gipugos sa pagpares aron masiguro ang ilang status sa pagpares; Paglabay sa 2 ka adlaw, gikontak sila sa ubang mga lalaki nga nagdala og transgenic sperm aron masusi ang re-mating rates pinaagi sa quantitative PCR detection sa transgene.d, Ang mga babaye nga gipakaon sa dugo nga gipares sa mga lalaki nga gipahilom sa EPP adunay dakong pagkunhod sa fertility (P < 0.0001; Mann-Whitney test, two-sided) ug gamay nga pagkunhod sa gidaghanon sa itlog (P = 0.088, Mann-Whitney test, two-sided), samtang ang spawning rate wala maapektuhan (P = 0.94, Fisher's exact test, two-sided). Sa tanang panel, ang n nagrepresentar sa gidaghanon sa mga sample sa lamok nga independente sa biyolohikal.NS, dili significant.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Sunod, among gisusi kung ang ecdysone dephosphorylation importante ba sa pag-aghat sa resistensya sa pagminyo sa mga babaye. Ilabi na, ang mga babaye nga nakigminyo sa mga lalaki nga kulang sa EPP nakigminyo pag-usab sa mas taas nga frequency (44.9%) kaysa sa mga babaye nga kontrol (10.4%) kung naladlad sa dugang (transgenic) nga mga lalaki (Fig. 3c). Nakita usab namo ang usa ka hinungdanon nga pagkunhod sa pertilidad (Fig. 3d, wala) ug usa ka gamay nga pagkunhod sa gidaghanon sa mga itlog nga gipangitlog niining mga babaye (Fig. 3d, tunga), samtang ang porsyento sa mga itlog nga gipangitlog sa mga babaye (laing tubag nga nakuha sa mga babaye pinaagi sa pagminyo)) wala maapektuhan (Fig. 3d, tuo). Tungod sa naobserbahan nga espesipiko sa EPP alang sa 3D20E22P, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang pagpaaktibo sa 3D20E sa EPP nga gibalhin sa panahon sa pagminyo mahimong adunay hinungdanon nga papel sa pagpalong sa pagkadawat sa babaye sa dugang nga pagminyo, usa ka pamatasan nga kaniadto gipahinungod sa sekswal nga pagbalhin sa 20E. Busa, kini nga hormone nga espesipiko sa lalaki kusog usab nga nakaapekto sa pertilidad sa babaye.
Sunod, among gitandi ang mga kalihokan sa 20E ug 3D20E sa mga eksperimento sa pag-indyeksyon sa mga birhen nga hamtong na sa sekso gamit ang chemically synthesized nga 3D20E (Fig. 4a–c) ug komersyal nga mabatonan nga 20E. Among naobserbahan nga ang 3D20E mas epektibo kay sa 20E sa pagpugong sa pagkasensitibo sa babaye sa pag-mating sa duha ka konsentrasyon (Fig. 4d). Talalupangdon nga katunga sa pisyolohikal nga lebel sa 3D20E sa LRT (1,066 pg post-injection vs. 2,022 pg post-mating) nakaaghat og proporsyon sa mga babaye nga dili mogana nga 20 ka pilo nga mas taas kay sa pisyolohikal nga lebel sa 20E (361 pg post-injection) 24 oras human sa indyeksyon sa pinakataas nga konsentrasyon nga 18 pg post-mating; Extended Data Table 1). Kini nga resulta nahiuyon sa ideya nga ang sekswal nga pagbalhin sa 20E dili hinungdan sa mga panahon sa pagminyo nga dili matinahuron, ug dugang nga nagpunting sa 3D20E isip usa ka mayor nga hinungdan sa pagsiguro sa relasyon sa ginikanan ug anak. Ang 3D20E mas aktibo usab kay sa 20E sa mga egg-laying assay sa mga birhen nga babaye (Fig. 4e), nga nagsugyot nga ang normal nga rate sa pagpanganak nga among naobserbahan human sa partial EPP silencing tungod sa presensya sa nahabilin nga kalihokan sa 3D20E nga gihimo gihapon sa mga hinungdan sa babaye nga gipahinabo sa pagminyo.
(a,b) 3D20E nga gi-synthesize sa kemikal gikan sa 20E (a) nga adunay taas kaayo nga conversion/efficiency (data nga gipresentar isip mean ± sem gikan sa tulo ka independente nga synthesis reactions) (b).c, Mass spectrum (ubos nga katunga) eksaktong motakdo sa ecdysone nga nakit-an sa gipares nga babaye nga LRT (ibabaw nga katunga).d, Kung itandi sa 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher's exact test, two-sided) ug 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher's exact test, 2-sided), samtang ang 20E mas taas kay sa control sa mas taas nga dosis (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fisher's exact test, 2-sided).e, Ang 3D20E injection nakapahinabog mas taas nga spawning rates sa mga birhen nga babaye kaysa 10% nga ethanol controls (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Fisher's exact test, two-sided), samtang ang 20E kon itandi sa controls sa mas taas nga dosis (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Fisher's exact test, two-sided). Ang 3D20E nakapahinabog mas taas nga spawning rates kaysa 20E sa mas taas nga dosis (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Fisher's exact test, two-sided). Sa tanang panel, ang n nagrepresentar sa gidaghanon sa mga biologically independent nga sample sa lamok. Ang NS, dili significant.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Ang datos gikan sa tulo ka replika.
Sa mga nangaging pagtuon, among natino nga ang pagbalhin sa sekso sa mga steroid hormone nag-aghat sa ekspresyon sa MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), usa ka babaye nga reproductive gene nga nanalipod sa mga babaye nga A. gambiae gikan sa impeksyon sa P. falciparum. Ang mga gasto sa panglawas gipahinabo sa 13, ang labing makamatay nga parasito sa malaria sa tawo. Tungod sa kahinungdanon sa MISO sa reproductive fitness sa Anopheles sa mga lugar nga endemic sa malaria, nakahukom kami nga mahibal-an kung unsang hormone ang 3D20E o 20E ang nag-trigger sa ekspresyon niini nga gene. Nakita namo nga samtang ang 20E injection espesipiko o mas kusgan nga nag-aghat sa pipila ka nuclear hormone receptors (HR), sama sa HR3 ug HR4, ug tipikal nga downstream steroid targets, sama sa yolkogenic genes nga Vg14, 15, 16, ang MISO mas kusog nga giaghat sa 3D20E (Extended Data Fig. 3). Busa, ang pagbalhin sa sekso niining androgenic steroid hormone daw nag-aghat sa mga mekanismo nga nanalipod sa mga babaye gikan sa mga gasto nga gipahinabo sa impeksyon sa parasito. Dugang pa, ang 3D20E lahi nga nakaapekto sa duha ka isoform sa Ang E receptor nga EcR, nga nag-aghat sa EcR-A ug nagpugong sa EcR-B, ug mas kusog nga nag-trigger sa ubang mga gene nga nag-aghat sa pagminyo, lakip ang HPX15, nga makaapekto sa pertilidad sa babaye. Kini mahimong makapasabut sa dakong pagkabaog nga naobserbahan sa mga babaye nga nakigminyo sa mga lalaki nga gipahilom sa EPP (Extended Data Fig. 3). Kini nga datos nagsugyot sa paglungtad sa mga agianan sa ubos nga bahin nga mas gipaaktibo sa duha ka ecdysone hormones nga mahimong hinungdan sa function nga espesipiko sa sekso.
Sunod, among gisulayan ang function sa duha ka EcK genes nga giila sa among bioinformatics pipeline. Ang pagpahilom sa EcK1 o EcK2 miresulta sa dakong mortalidad sa mga lalaki (Extended Data Fig. 4a), nga nagsugyot nga ang ecdysone phosphorylation, ug busa ang inactivation, importante alang sa survival. Tungod kay ang EcK2 gipahayag sa mas taas nga lebel kaysa EcK1 ug nakita sa MAGs pinaagi sa proteomics (Fig. 2b,c ug Supplementary Table 2), among gi-validate ang ecdysteroid kinase activity niini pinaagi sa pag-incubate niini sa 20E, nga miresulta sa phosphorylation 20E22P (Extended Data Figure 2).4b). Sa paggamit sa 3D20E isip substrate, wala namo makita ang phosphorylated product nga 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), nga nagsugyot nga ang 20E imbes nga 3D20E mahimong ang gipalabi nga target sa EcK2.
Sumala sa among RNA-seq analysis, ang EcK2 taas usab nga gipahayag sa LRT sa mga birhen nga babaye, diin kini gipalong human sa pag-mating (Fig. 2b). Gikumpirma namo kini nga datos ug natino nga ang ekspresyon sa EcK2 wala maapektuhan sa pagpakaon sa dugo (Extended Data Fig. 5a). Sa pagpalapad sa among inisyal nga mga eksperimento sa MS, among natino nga ang kinatas-ang bahin sa 20E22P suod nga nalambigit sa kinatas-ang bahin sa 20E (22-26 ka oras human sa pagkaon sa dugo; Extended Data Fig. 5b). Ang pagpahilom sa EcK2 sa mga birhen nga babaye miresulta sa 3 ka pilo nga pagtaas sa relatibong ratio sa 20E ngadto sa 20E22P sa 26 ka oras human sa pagkaon sa dugo (Extended Data Figures 2c ug 5c), nga nagpamatuod nga ang EcK2 nag-phosphorylate usab sa 20E sa mga babaye. Talalupangdon, ang mga birhen nga nahutdan og EcK2 nagpabilin sa hingpit nga pagdawat sa sekswal (Extended Data Fig. 5d,e), nga dugang nga nagsugyot nga ang produksiyon sa babaye sa 20E wala mag-induce sa mga panahon sa pag-mating nga dili makontrol. Bisan pa, kini nga mga babaye adunay dakong pagtaas sa gidaghanon sa pagpangitlog kon itandi sa mga kontrol, nga adunay kapin sa 30% sa mga birhen ang nangitlog (Extended Data Fig. 5f). Kon ang double-stranded Eck2 RNA (dsEcK2) injections gihimo human sa pagpakaon og dugo, ang pagpangitlog wala mahitabo, diin ang 20E peak tungod sa pagtulon og dugo mikunhod. Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsuporta sa usa ka modelo nga ang 20E nga gihimo human sa pagsuso og dugo mahimong makaaghat sa pagpangitlog, apan kon ang spawning block (EcK2 ug posible nga uban pang mga hinungdan) mapalong pinaagi sa pagpares. Ang 20E o 3D20E injections wala makapugong sa ekspresyon sa EcK2 sa mga birhen (Extended Data Fig. 5g), nga nagsugyot nga ang ubang mga hinungdan nagpataliwala sa pagpugong niini nga kinase. Bisan pa, ang lebel sa 20E human sa pagpakaon og dugo dili igo aron makaaghat sa kahasol sa pagpares, apan epektibo nga na-trigger sa taas nga titers sa sexually transferred 3D20E.
Ang among mga resulta naghatag ug importanteng mga panabut sa mga mekanismo nga nag-regulate sa kalampusan sa reproduktibo sa A. gambiae. Usa ka modelo ang mitumaw diin ang mga lalaki nag-uswag aron makahimo og taas nga titers sa 3D20E, usa ka male-specific modified ecdysone nga nagsiguro sa ginikanan pinaagi sa pag-desensitize sa mga babaye sa dugang nga pagminyo. Sa samang higayon, kini nga mga malaria vector nakaugmad usab og usa ka episyente nga sistema aron ma-activate ang 3D20E sa mga babaye agig tubag sa sekswal nga pagbalhin sa male-specific EPP. Sa among nahibaloan, kini ang unang ehemplo sa usa ka sistema sa steroid hormone nga gidominar sa lalaki ug babaye nga naghimo og talagsaon ug kritikal nga function sa mga insekto. Ang function sa male-specific ecdysone gi-postulate apan wala pa hingpit nga napamatud-an. Pananglitan, usa ka kadaghanan nga napamatud-an nga hypothesis 18 mao nga kini nga mga function mahimong gihimo sa 20E precursor E1. Nahibal-an nga sa Drosophila, ang monandry gi-trigger sa sekswal nga pagbalhin sa gagmay nga sex peptides 19,20 nga nakig-interact sa mga neuron nga nag-innervate sa babaye nga reproductive tract pinaagi sa piho nga sex peptide receptors 21,22. Gikinahanglan ang dugang nga trabaho aron mahibal-an ang downstream signaling. mga cascade nga gikontrol sa 3D20E sa mga babaye nga A. gambiae ug aron mahibal-an kung kini nga mga cascade mapreserbar ba taliwala sa mga lamok ug Drosophila.
Tungod sa importanteng papel sa 3D20E sa pertilidad ug pamatasan sa babaye nga giila sa among pagtuon, ang mga agianan nga padulong sa sintesis ug pagpaaktibo sa 3D20E nagtanyag og bag-ong mga oportunidad alang sa umaabot nga mga estratehiya sa pagkontrol sa lamok, sama sa pagmugna og kompetisyon nga mga sterile nga lalaki sa mga estratehiya sa teknolohiya sa sterile nga insekto. Gamiton alang sa wild release o pagsundog sa 3D20E sa virgin play. Ang function sa 3D20E nga espesipiko sa lalaki mahimong miuswag sa dihang ang A. gambiae ug uban pang mga espisye sa Cellia nakakuha sa abilidad sa pag-coagulate sa ilang semilya ngadto sa mating plugs, tungod kay kini nagtugot sa episyente nga pagbalhin sa daghang mga hormone ug mga hormone-activating enzymes. Sa baylo, ang ebolusyon sa 3D20E nga nagpatuman sa monandry naghatag og mekanismo alang sa mga babaye (pinaagi sa taas nga ekspresyon sa MISO) aron paboran ang ilang reproductive fitness sa mga lugar nga taas ang pagkaylap sa malaria, nga dili direkta nga nakatampo sa pagpasa sa Plasmodium. Tungod kay ang babaye nga 20E gipakita nga adunay lawom nga epekto sa pagkabuhi ug pagtubo sa P. falciparum sa babaye nga mga lamok nga Anopheles,24 ang mga agianan sa steroid hormone sa lalaki ug babaye karon mga hinungdanon nga aspeto sa interaksyon sa lamok-parasito.
Ang mga strain sa A. gambiae G3 gipadako ubos sa standard nga mga kondisyon sa insekto (26-28 °C, 65-80% relatibong humidity, 12:12 h nga kahayag/ngitngit nga photoperiod). Ang mga ulod gipakaon og powdered fish food (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ug Tetra Pond Sticks sa ratio nga 7:7:2). Ang mga hamtong nga lamok gipakaon og ad libitum nga 10% dextrose solution ug semanal nga dugo sa tawo (tun-an ang mga sangkap sa dugo). Ang mga birhen nga lamok nakuha pinaagi sa paglainlain sa mga sekso sa yugto sa pupal human sa pagsusi sa mga tumoy pinaagi sa microscopy. Ang mga lalaki nga nagdala sa DsRed transgene gihulagway na kaniadto.
Ang mga eksperimento sa pinugos nga pagminyo gihimo sumala sa mga protocol nga gihulagway kaniadto. Alang sa natural nga pagminyo, ang 4 ka adlaw nga ulay nga mga babaye gihuptan sa 1:3 nga ratio uban sa mga ulay nga lalaki nga hamtong na sa sekso sulod sa duha ka gabii. Alang sa mga eksperimento diin ang mga lalaki gi-injectan og dsEPP, ang co-caging nahitabo sa ika-3-4 nga adlaw human sa injection, diin ang kalihokan sa phosphatase nahilom sa labing taas nga lebel (Extended Data Fig. 2b).
Ang mga tisyu sa lamok, nahibiling mga patayng lawas (nahibiling bahin sa lawas), o tibuok lawas gihiwa-hiwa ngadto sa 100% methanol ug gi-homogenize gamit ang beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 sec). Ang gidaghanon sa tisyu ug gidaghanon sa methanol mao ang mosunod: nahibiling bahin sa lawas, 50 sa 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; babaye nga LRT, 25–50 80 µl. Ang precipitate gipailalom sa ikaduhang methanol extraction nga adunay parehas nga gidaghanon sa methanol. Ang mga debris sa selula gikuha pinaagi sa centrifugation. Ang methanol gikan sa duha ka extraction gihiusa ug gipauga ubos sa nitrogen flow, dayon gi-resuspend sa mosunod nga gidaghanon sa 80% methanol sa tubig: nahibiling bahin sa lawas, 50 µl; MAGs ug babaye nga LRT, 30 µl.
Ang mga sample gi-analisa sa usa ka mass spectrometer (ID-X, Thermo Fisher) nga konektado sa usa ka LC instrument (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl nga sample ang gi-inject sa usa ka 3 µm, 100 × 4.6 mm nga column (Inspire C8, Dikma) nga gimentinar sa 25 °C. Ang mga mobile phase para sa LC mao ang A (tubig, 0.1% formic acid) ug B (acetonitrile, 0.1% formic acid). Ang LC gradient mao ang mosunod: 5% B sulod sa 1 ka minuto, dayon dugangan ngadto sa 100% B sulod sa 11 ka minuto. Human sa 8 ka minuto sa 100%, i-re-equilibrate ang column sa 5% B sulod sa 4 ka minuto. Ang flow rate kay 0.3 ml min-1. Ang ionization sa MS source gihimo pinaagi sa gipainit nga electrospray ionization sa positibo ug negatibo nga mga mode.
Ang mass spectrometer nagsukod sa datos sa m/z range gikan sa 350 hangtod 680 sa 60,000 nga resolusyon sa bug-os nga MS mode. Ang datos sa MS/MS nakuha sa [M + H]+ (tanang target), [M - H2O + H]+ (tanang target), ug [M - H]- (mga phosphorylated target). Gigamit ang datos sa MS/MS aron kumpirmahon ang mga kabtangan sa ecdysone sa mga target nga walay magamit nga standard. Aron mailhan ang mga dili-targeted nga ecdysteroid, gisusi ang datos sa MS/MS para sa tanang HPLC peaks nga adunay >15% nga relatibong kadagaya. I-kwantipika gamit ang standard curves nga gihimo gikan sa puro nga mga standard (20E, 3D20E) aron makalkulo ang hingpit nga kantidad o mga dilution sa usa ka piho nga sample (tanang ubang target) aron makalkulo ang ilang katumbas sa kantidad nga nakit-an sa usa ka lalaki. Para sa 3D20E, gihimo ang quantification gamit ang suma sa mosunod nga mga adduct: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Ang datos gikuha ug gi-kwantipika gamit ang Tracefinder (bersyon 4.1). Ang datos sa MS/MS gi-analisar gamit ang Xcalibur (bersyon 4.4). Ang MS spectra sa E, 20E ug 3D20E gitandi sa tagsa-tagsa ka mga sumbanan. Ang 3D20E22P gi-analisar pinaagi sa derivatization gamit ang Girard's reagent. Ang 20E22P gi-analisar pinaagi sa m/z ratio.
Ang 3D20E22P giputli gikan sa MAG. Ang pagputli gihimo sa usa ka analytical scale gamit ang usa ka ultra-performance liquid chromatograph (Acquity, Waters) nga adunay quadrupole mass-based detector (QDa, Acquity, Waters) ubos sa parehas nga mga kondisyon sa LC sama sa HPLC-MS/MS analysis. Ang pagkolekta sa fraction na-trigger sa dihang ang m/z nga katumbas sa 3D20E22P nakit-an sa parehas nga oras sa pagpabilin nga gitino kaniadto. Ang kaputli sa nakuha nga mga compound gisusi dayon pinaagi sa HPLC-MS/MS sama sa gihulagway sa ibabaw.
Ang kinatibuk-ang RNA gikuha gikan sa 10-12 ka mga tisyu sa reproduktibo o ubang mga bahin sa lawas (walay ulo) gamit ang TRI reagent (Thermo Fisher) nga nagsunod sa mga instruksyon sa tiggama. Ang RNA gitambalan gamit ang TURBO DNase (Thermo Fisher). Ang cDNA gi-synthesize gamit ang Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) nga nagsunod sa mga instruksyon sa tiggama. Ang mga primer para sa reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) gipatik kaniadto24 o gidisenyo gamit ang Primer-BLAST26, nga adunay prayoridad nga gihatag sa mga produkto nga 70-150 bp ang gidak-on ug naglangkob sa exon-exon junctions o Primer pair primers nga managlahing exons. Ang mga sample sa cDNA gikan sa tulo ngadto sa upat ka biological replicates gi-dilute upat ka pilo sa tubig para sa RT-qPCR. Ang quantification gihimo sa 15 µl nga replicate replicate reactions nga adunay 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), mga primer, ug 5 µl nga diluted cDNA. Ang mga reaksyon gipadagan sa usa ka QuantStudio 6 Pro. Ang real-time PCR system (Thermo Fisher) ug ang datos gikolekta ug gi-analisa gamit ang Design and Analysis (bersyon 2.4.3). Sama sa gipakita niini nga pagtuon, ang relatibong kantidad gi-normalize sa ribosomal gene nga RpL19 (AGAP004422), kansang ekspresyon wala kaayo mausab sa blood feeding 27 o mating 3.
Ang kalidad sa RNA gisusi gamit ang Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Ang mga paired-end libraries sa Illumina giandam ug gipadagan sa Broad Institute sa MIT ug Harvard. Ang mga sequencing read gi-align sa A. gambiae genome (PEST strain, bersyon 4.12) gamit ang HISAT2 (bersyon 2.0.5) nga adunay default parameters. Ang mga read nga adunay mapping quality (MAPQ) scores nga <30 gitangtang gamit ang Samtools (bersyon 1.3.1). Ang gidaghanon sa mga read nga gimap sa mga gene giihap gamit ang htseq-count (bersyon 0.9.1) nga adunay default parameters. Ang mga normalized read count gikalkulo ug ang differential gene expression gi-analyze gamit ang DESeq2 package (bersyon 1.28.1) sa R ​​(bersyon 4.0.3).
Ang mga kandidato sa gene nga nag-modify sa Ecdysone giila pinaagi sa pagpangita una sa genome sa A. gambiae gamit ang PSI-BLAST algorithm (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), gamit ang default values ​​nga Parameters nga adunay mosunod nga query protein sequences: gikan sa Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 ug XP_011294434.1) ug Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 ug XP_008552645.1) EcK gikan sa B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), Apis mellifera (Accession No. XP_394838) ug Acyrthosiphon pisum (Accession No. XP_001947166); ug EPP gikan sa B. mori (Accession No. XP_001947166) NP_001177919.1 ug NP_001243996.1) ug EO sa D. melanogaster (Accession No. NP_572986.1) (lakang 1). Sunod, i-filter ang mga hit base sa taas nga mRNA expression (>100 fragments/kilobase exons per million mapped reads (FPKM) o >85%) sa reproductive tissue (babaye nga LRT o MAG) sa Gambia (lakang 2). Aron mapauswag ang espesipiko, among gipili ang mga kandidato nga enzyme nga gipahayag usab sa tisyu sa pagsanay sa A. albimanus, usa ka espisye sa anopheles nga wala mag-synthesize o magbalhin sa ecdysone atol sa pagpares. Ang mga kandidato nga gene gisala base sa ubos nga ekspresyon (<100 FPKM o <85th percentile) sa tisyu sa pagsanay sa A. albimanus (lakang 3). Isip katapusang filter (lakang 4), ang mga kandidato nga gene kinahanglan nga makatagbaw sa labing menos usa sa mga musunod: (1) miusbaw pag-ayo human sa pagpares (P < 0.05) sumala sa pag-analisar sa mga gene nga lainlain ang ekspresyon ug (2) sa mga tisyu nga dili reproduktibo (< 85% o <100 FPKM).
Among giusab ang mga pamaagi nga gihulagway kaniadto 28, 29, 30 aron makab-ot ang whole-organism isotopic labeling. Sa mubo, ang wild-type nga Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) gisulayan sa yeast nitrogen base (BD Difco, DF0335) nga adunay (wt/vol) 2% glucose (G7528, Sigma), 1.7% amino acid-free ug ammonium sulfate (culture medium) ug 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) isip bugtong tinubdan sa nitrogen. Ang yeast nakuha pinaagi sa centrifugation ug ang mga ulod sa lamok gipakaon ad libitum hangtod sa pupation. Gidugangan og fishmeal (0.5 mg kada 300 ka ulod) aron malikayan ang mortalidad sa ikaupat nga instar. Ang mga babaye ra ang gigamit sa mga eksperimento sa pag-mating sa mga lalaki nga walay label aron analisahon ang laki nga proteome nga gibalhin atol sa pag-mating.
Ang 4-6 ka adlaw nga edad nga 15N-tagged nga mga birhen nga babaye gipugos sa pagpares sa mga lalaki nga birhen nga parehas og edad ug wala pa ma-tag. Ang malampuson nga pagpares napamatud-an pinaagi sa pag-detect sa mga plug sa pagpares ubos sa epifluorescence microscopy. Sa 3, 12, ug 24 hpm, ang atria sa 45-55 ka gipares nga mga babaye gi-dissect ngadto sa 50 µl nga ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) ug gi-homogenize gamit ang pestle. Ang homogenate gi-centrifuge ug ang supernatant gisagol sa 50 µl nga 0.1% RapiGest (186001860, Waters) sa 50 mM ammonium bicarbonate. Ang supernatant ug pellet gikan sa matag sample gi-snap frozen sa dry ice ug gipadala tibuok gabii sa MacCoss laboratory sa University of Washington, diin nahuman ang pag-andam sa sample para sa LC-MS/MS. I-resuspend ang pellet sa 50 µl nga 0.1% RapiGest sa 50 mM ammonium bicarbonate ug i-sonicate sa usa ka water bath. Ang konsentrasyon sa protina sa pellet ug supernatant gisukod pinaagi sa BCA assay, ang mga sample gipakunhod gamit ang 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), gi-alkylate gamit ang 15 mM iodoacetamide (Sigma) ug gi-incubate sa 37 °C (1:0 50) sulod sa 1 ka oras gamit ang trypsinization: trypsin:substrate ratio). Ang RapiGest gi-lyse pinaagi sa pagdugang og 200 mM HCl, gisundan sa incubation sa 37 °C sulod sa 45 minutos ug centrifugation sa 14,000 rpm sulod sa 10 minutos sa 4 °C aron makuha ang mga debris. Ang mga sample gihugasan pinaagi sa dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) ug gi-resuspend sa 0.1% formic acid para sa final protein concentration nga 0.33 µg µl-1. Ang mga unlabeled MAG proteome parehas nga gi-analisa gikan sa mga virgin nga lalaki. Duha ka analytical replicates ang gi-analisa para sa matag usa. sampol. Sunod, 1 µg sa matag usa ang gisusi gamit ang 25-cm fused silica 75-μm column nga adunay 4-cm fused silica Kasil1 (PQ) frit trap nga giputos sa Jupiter C12 reversed-phase resin (Phenomenex) ug 180-minutos nga liquid chromatography. Mga sample digest – Ang MS/MS gipadagan sa usa ka Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) nga adunay nanoACQUITY UPLC System (Waters). Ang datos sa pagkuha nga may kalabotan sa datos nga gihimo alang sa matag pagdagan gi-convert sa mzML format gamit ang Proteowizard (bersyon 3.0.20287) ug gamit ang Comet31 (bersyon 3.2) batok sa FASTA database nga adunay mga sequence sa protina gikan sa Anopheles gambiae (VectorBase bersyon 54), Anopheles coluzzi. Usa ka pagpangita ang gihimo sa Mali-NIH (VectorBase bersyon 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Marso 2021), A. gambiae RNA-seq, ug tulo ka frame nga mga hubad sa nahibal-an nga mga kontaminante sa tawo. Ang mga peptide map-matched FDR gitino gamit ang Percolator32 (bersyon 3.05) nga adunay threshold nga 0.01, ug ang mga peptide gi-assemble ngadto sa mga identification sa protina gamit ang protein parsimony sa Limelight33 (bersyon 2.2.0). Ang relatibong kadagaya sa protina gibanabana gamit ang normalized spectral abundance factor (NSAF) nga gikalkulo alang sa matag protina sa matag pagdagan sama sa gihulagway kaniadto. Ang NSAF nga may kalabotan sa matag protina gi-average sa mga sample gikan sa duha ka lainlaing biological replicates. Malampusong natabonan sa 15N nga pag-label ang babaye nga proteome, bisan kung gamay ra nga kantidad sa wala’y label nga protina ang nakit-an gikan sa gimarkahan nga mga virgin. Among natala ang pag-detect sa pagkunhod sa protina sa lalaki (1-5 spectra) sa hilaw nga mga sample sa babaye lamang sa mga teknikal nga pagdagan, diin ang hilaw nga mga sample gipadagan pagkahuman sa mga sample sa lalaki/mating, ingon usa ka resulta sa HPLC nga "carry over". Ang mga protina nga nakit-an nga 'mga kontaminante' gikan sa gimarkahan nga mga virgin gilista sa Supplementary Table 1.
Duha ka antigenic peptides, ang QTTDRVAPAPDQQQ (sulod sa isotype PA) ug MESDGTTPSGDSEQ (sulod sa isotype PA ug PB) sa Genscript. Ang duha ka peptides gihiusa, dayon gi-conjugate sa carrier protein nga KLH ug gi-inject sa mga koneho sa New Zealand. Ang mga koneho gi-ihaw human sa ikaupat nga injection, ug ang total IgG gi-isolate pinaagi sa affinity purification. Ang IgG gikan sa pinaka-EPP-specific nga koneho gigamit alang sa dugang nga western blotting.
Para sa western blots, ang MAG (n = 10, diin ang n nagrepresentar sa gidaghanon sa mga sample sa lamok nga independente sa biyolohikal) ug babaye nga LRT (n = 30) gikan sa 4 ka adlaw nga birhen nga mga lalaki ug birhen o force-mated nga mga babaye (<10 post-mating), Protein extraction buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) gidugang nga gilain. Ang mga sample gi-homogenize dayon human sa dissection gamit ang beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 sec). Ang dili matunaw nga mga debris gikuha pinaagi sa centrifugation sa 20,000 g sa 4 °C. Ang mga protina gi-quantify pinaagi sa Bradford assay (Bio-Rad). Dayon, 20 µg sa MAG protein, 40 µg sa LRT protein, ug 20 µg sa residual bulk protein ang gikuha. gi-denatured ug gibulag sa 10% Bis-Tris NuPAGE gamit ang MOPS buffer. Ang mga protina gibalhin ngadto sa mga lamad sa polyvinylidene fluoride gamit ang iBlot2 transfer system (Thermo Fisher). Ang mga lamad gihugasan kaduha sa 1× PBS-T (0.1% Tween-20 sa PBS) ug dayon gibabagan sa Odyssey blocking buffer (Li-Cor) sulod sa 1 ka oras sa 22°C. Ang mga lamad giuyog tibuok gabii sa 4°C gamit ang custom rabbit anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 sa blocking buffer) ug rat anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000). Ang mga lamad gihugasan gamit ang PBS-T ug dayon gi-incubate uban sa secondary antibodies (donkey anti-rabbit 800CW ug goat anti-rat 680LT (Li-Cor), parehong 1:20,000) sa blocking buffer nga adunay 0.01% SDS ug 0.2% Tween -20 sulod sa 1 ka oras sa 22 °C. Ang mga lamad gihugasan gamit ang PBS-T ug gikuhaan og imahe gamit ang Odyssey CLx scanner. Ang mga imahe gikolekta ug giproseso sa Image Studio (bersyon 5.2). Walay nakitang espesipikong banda nga katumbas sa EPP-RA isoform (82 kDa).
Ang mga coding region sa EPP (isip isoform nga AGAP002463-RB nga adunay histidine phosphatase domain, NCBI conserved domain search 34) ug EcK2 (AGAP002181) gi-clone ngadto sa pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); Ang mga primer gilista sa Extended Data Table 2. Walo ka GS4 linkers (in tandem) ang gisal-ot sa wala pa ang C-terminal 6xHis tag sa pET-21a(+)-EcK2 construct. Ang mga recombinant nga protina gihimo gamit ang NEBExpress cell-free E. coli protein synthesis reaction (New England BioLabs). Ang mga recombinant nga protina giputli gamit ang NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs). Ang dihydrofolate reductase (DHFR) control protein gihimo gamit ang DNA template gikan sa NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Ang mga protina gitipigan sa 50% glycerol sa PBS sa -20 °C hangtod sa 3 ka bulan.
Ang kalihokan sa phosphatase sa EPP ug mga kinuha sa tisyu gisukod gamit ang 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Ang reaction buffer adunay sulod nga 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ug 1 mM DTT. Ang tisyu gi-homogenize sa reaction buffer ug ang mga debris sa selula gikuha pinaagi sa centrifugation. Sugdi ang reaksyon pinaagi sa pagdugang og enzyme o tissue extract sa reaction buffer nga adunay sulod nga 2.5 mg ml-1 pNPP. Ang sagol nga reaksyon gi-incubate sa temperatura sa kwarto sa ngitngit, ug ang gidaghanon sa pNP nga nakabig gikan sa pNPP gi-quantify pinaagi sa pagsukod sa absorbance sa 405 nm sa lain-laing mga oras.
Para sa in vitro nga EcK activity, ang protina gi-incubate sa 0.2 mg 20E o 3D20E sa 200 µl buffer (pH 7.5) nga adunay 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ug 10 mM MgCl2 sulod sa 2 ka oras sa 27 °C. Ang reaksyon gipahunong pinaagi sa pagdugang og 800 µl methanol, dayon gipabugnaw sa -20 °C sulod sa 1 ka oras, dayon gi-centrifuge sa 20,000 g sulod sa 10 ka minuto sa 4 °C. Ang supernatant gi-analisa dayon gamit ang HPLC-MS/MS. Aron ma-heat-inactivate ang mga protina nga gigamit sa control group, ang mga protina gi-incubate sa 50% glycerol sa PBS sulod sa 20 ka minuto sa 95°C.
Para sa in vitro nga kalihokan sa EPP, ang protina gi-incubate sa 3D20E22P (katumbas sa gidaghanon nga makita sa 18 ka pares sa MAG, nga giputli pinaagi sa HPLC-MS/MS) sa 100 µl buffer (pH 7.5) nga adunay sulod nga 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ug 1 mM DTT sulod sa 3 ka oras sa 27 °C. Ang reaksyon gipahunong pinaagi sa pagdugang og 400 µl methanol ug gipabugnaw sa -20 °C sulod sa 1 ka oras, dayon gi-centrifuge sa 20,000 g sulod sa 10 ka minuto sa 4 °C. Ang supernatant gi-analisa pinaagi sa HPLC-MS/MS.
Ang mga tipik sa PCR para sa EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ug EcK2 (556 bp) gi-amplify gikan sa cDNA nga giandam gikan sa mga patayng lawas sa lamok nga walay ulo nga gisagol ang sekso. Ang tipik sa PCR sa eGFP control (495 bp) gi-amplify gikan sa naunang gihulagway nga pCR2.1-eGFP; Ang mga PCR primer gilista sa Extended Data Table 2. Ang PCR fragment gisulod taliwala sa inverted T7 promoters sa pL4440 plasmid. Ang mga plasmid construct nakuha gikan sa NEB 5-α competent E. coli (New England Biolabs) ug gi-verify pinaagi sa DNA sequencing sa dili pa gamiton (tan-awa ang Supplementary Data 1 para sa insert sequence). Ang mga primer nga gipares sa T7 promoter (Extended Data Table 2) gigamit aron ma-amplify ang insert gikan sa pL4440-based plasmid. Ang gidak-on sa produkto sa PCR gikumpirma pinaagi sa agarose gel electrophoresis. Ang dsRNA gi-transcribe gikan sa PCR templates gamit ang Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ug gi-purified sumala sa mga instruksyon sa tiggama gamit ang mga pagbag-o nga gihulagway kaniadto.
Para sa dsRNA injection, 1,380 ng sa dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ang gi-inject sa konsentrasyon nga 10 ng nl-1 ngadto sa thorax sa mga hamtong nga lalaki o babaye (Nanoject III, Drummond) sulod sa 1 ka adlaw human sa eclosion. Ang gene knockdown levels gitino sa labing menos tulo ka biological replicates pinaagi sa RNA extraction, cDNA synthesis, ug RT-qPCR. Para sa ecdysone injection, ang 4-ka-adlaw nga birhen o 6-ka-adlaw nga birhen nga mga babaye nga gipakaon sa dugo gi-injectan og 0.13, 0.21, o 0.63 µg sa 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) sa konsentrasyon nga 1.3, 2.1, matag usa, depende sa experimental design o 6.3 ng nl-1. I-inject ang 100 nl nga 10% (vol/vol) nga ethanol sa tubig; 100 nl nga 3D20E22P sa 10% ethanol (katumbas sa 75% sa gidaghanon nga makita sa usa ka pares sa MAGs). Ang mga lamok random nga gi-assign sa grupo sa ineksiyon.
Para sa mga spawning assay, ang 3 ka adlaw nga edad nga mga baye gipakaon og dugo sa tawo nga ad libitum. Kuhaa ang mga lamok nga partially feeded o wala feeded. Depende sa treatment, ang mga baye gibutang sa managlahing spawning cups sulod sa upat ka gabii labing menos 48 ka oras human sa blood meat. Ang mga itlog giihap ubos sa stereoscope (Stemi 508, Zeiss); para sa mga baye nga nakighilawas, ang mga itlog nga napusa ug nahimong ulod giisip nga fertile.
Alang sa mga pagsulay sa pagpares, ang mga babaye gitugotan og labing menos 2 ka adlaw depende sa pagtambal aron makaugmad og resistensya sa pagpares, ug ang mga lalaking wild-type age-matched gipailalom sa samang hawla. Duha ka gabii ang milabay, ang mga babaye nga napertilisa nga mga vesicle gi-dissect ug ang genomic DNA gipagawas pinaagi sa freeze-thaw ug sonication sa usa ka buffer nga adunay 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, ug 25 mM NaCl (pH 8.2). Ang mga sample gi-incubate sa Proteinase K (0.86 µg µl-1) sulod sa 15 minutos sa 55 °C, gisundan sa 10 minutos sa 95 °C. Ang krudo nga genomic DNA preparations gi-dilute og 10-fold ug gipailalom sa qPCR detection sa Y chromosome sequences; ang mga primer gilista sa Extended Data Table 2. Ang pagkawala sa Y chromosome sequence nagpakita nga walay pagpares.
Para sa mga re-mating assay, ang mga babaye nga gipugos pagminyo gisusi alang sa presensya sa mga mating plug aron makumpirma ang kahimtang sa pagminyo ug gitugotan ang 2 ka adlaw aron maugmad ang refractoriness sa pagminyo kung wala ang mga lalaki, sama sa gihulagway kaniadto 36. Ang mga lalaki nga nagdala sa DsRed transgenic sperm gipailalom dayon sa mga hawla sa babaye. Duha ka gabii ang milabay, ang mga fertilizing vesicle gi-dissect gikan sa mga babaye, ug ang genomic DNA giandam sama sa gihulagway sa ibabaw ug gipailalom sa qPCR detection sa DsRed transgene; ang mga primer gilista sa Extended Data Table 2. Ang pagkawala sa DsRed transgene nagpakita nga walay nahitabong re-mating.
Ang 3D20E gi-synthesize sama sa gihulagway kaniadto 37. Sa mubo, 10 mg sa 20E (Sigma-Aldrich) gitunaw sa 10 ml nga tubig, gisundan sa pagdugang sa 30 mg nga platinum black (sa porma sa pulbos, Sigma-Aldrich). Usa ka hinay nga agos sa O2 ang padayon nga gibula sa sagol nga reaksyon, nga gikutaw sa temperatura sa kwarto. Pagkahuman sa 6 ka oras, 30 mL nga methanol ang gidugang aron mahunong ang reaksyon. Ang sagol gi-centrifuge aron makuha ang mga partikulo sa catalyst. Ang supernatant gi-evaporate hangtod nga mamala sa vacuum sa temperatura sa kwarto. Ang uga nga produkto sa reaksyon gitunaw sa 10% ethanol ug methanol para sa injection para sa HPLC-MS/MS analysis. Ang conversion rate (gikan sa 20E ngadto sa 3D20E) gibana-bana nga 97% (Fig. 4b), ug ang MS spectrum sa gi-synthesize nga 3D20E mitakdo sa nakit-an sa mga babaye nga gipares (Fig. 4c).
Ang leyenda adunay mga espesipikong detalye sa mga gihimong statistical test. Ang GraphPad (bersyon 9.0) gigamit sa paghimo sa Fisher's exact test, Mantel-Cox test, ug Student's t-test. Ang Cochran-Mantel-Haenszel tests gihimo gamit ang custom R script (anaa sa https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Ang data distribution gisulayan para sa normality gamit ang Shapiro-Wilk test nga adunay significance threshold nga 0.05. Sa dihang ang data napakyas sa normality test, gihimo ang Mann-Whitney test. Ang survival data gi-analisa gamit ang Mantel-Cox test. Ang DESeq2 package (bersyon 1.28.1) gigamit sa paghimo sa RNA-seq gene-level differential expression analysis. Ang horizontal bar sa graph nagrepresentar sa median. Ang significance value nga P = 0.05 gigamit isip threshold para sa tanang pagsulay.
Alang sa dugang nga kasayuran bahin sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang abstrak sa Nature Research Report nga nalambigit niini nga artikulo.
Ang MS proteomic data gideposito sa ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pinaagi sa PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) gamit ang dataset identifier nga PXD032157.
Ang RNA-seq dataset gibutang sa Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ubos sa serial record nga GSE198665.
Ang dugang nga mga dataset nga nahimo ug/o gisusi atol sa kasamtangang pagtuon mahimong makuha gikan sa katugbang nga mga tagsulat kung adunay makatarunganon nga hangyo. Kini nga artikulo naghatag sa tinubdan nga datos.
De Loof, A. Ecdysteroids: Gipasagdan nga mga steroid sa sekso sa insekto?Lalaki: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone ug paglambo sa obaryo sa Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).