Ang pag-sort sa protina sa secretory pathway importante para sa pagmintinar sa cell compartmentalization ug homeostasis. Gawas pa sa shell-mediated sorting, ang papel sa mga lipid sa kinesin sorting sa proseso sa secretory transport usa ka dugay nang sukaranang pangutana nga wala pa matubag. Dinhi, naghimo kami og 3D dungan nga multicolor high-resolution real-time imaging aron pamatud-an in vivo nga ang bag-ong na-synthesize nga glycosylphosphatidylinositol-immobilized proteins nga adunay taas kaayo nga ceramide lipid moieties gi-cluster ug giklasipikar ngadto sa espesyal nga endoplasms Net exit site, nga lahi sa gigamit sa transmembrane proteins. Dugang pa, gipakita namo nga ang gitas-on sa kadena sa ceramide sa endoplasmic reticulum membrane kritikal para niining sorting selectivity. Ang among pagtuon naghatag sa unang direkta nga in vivo nga ebidensya sa pag-classify sa mga protein cargoes base sa gitas-on sa lipid chain ngadto sa selective export sites sa secretory pathway.
Sa mga eukaryotic cells, ang mga protina nga gi-synthesize sa endoplasmic reticulum (ER) gi-sort dayon atol sa transportasyon pinaagi sa secretory pathway para sa paghatud sa ilang angay nga cellular destination (1). Gawas pa sa coat-mediated sorting, dugay nang gihunahuna nga ang pipila ka mga lipid mahimo usab nga magsilbing selective exit points pinaagi sa pag-cluster niini ngadto sa piho nga mga membrane domain nga adunay piho nga mga protina (2-5). Bisan pa, adunay gihapon kakulang sa direkta nga in vivo nga ebidensya aron pamatud-an kini nga posible nga mekanismo nga nakabase sa lipid. Aron masulbad kini nga batakang problema, among gitun-an sa yeast kung giunsa ang glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins (GPI-APs) lainlain nga gi-export gikan sa ER. Ang GPI-APs usa ka klase sa lipid-connected cell surface proteins (6, 7). Ang GPI-AP usa ka secreted protein nga gilakip sa gawas nga mga leaflet sa plasma membrane pinaagi sa glycolipid moiety (GPI anchor). Gidawat nila ang GPI anchors isip konserbatibo nga post-translational modifications sa ER lumen (8). Human sa pagkabit, ang GPI-AP moagi sa Golgi apparatus (5, 9) gikan sa ER ngadto sa plasma membrane. Ang presensya sa mga GPI anchor hinungdan nga ang GPI-AP madala nga gilain gikan sa mga transmembrane secreted protein (lakip ang ubang mga plasma membrane protein) subay sa secretory pathway (5, 9, 10). Sa mga yeast cell, ang mga GPI-AP gibulag gikan sa ubang mga secreted protein sa endoplasmic reticulum, ug dayon giputos sa talagsaon nga mga vesicle nga giputos sa coat protein complex II (COPII) (6, 7). Ang mga determinant niini nga proseso sa klasipikasyon sa proseso sa pag-export sa ER dili klaro, apan gituohan nga kini nga mekanismo mahimong magkinahanglan og mga lipid, labi na ang structural remodeling sa lipid nga bahin sa GPI anchor (5, 8). Sa yeast, ang GPI lipid remodeling magsugod dayon human sa pagkabit sa GPI, ug sa daghang mga kaso, kini hinungdan nga ang ceramide mogapos sa 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). Ang C26 ceramide mao ang pangunang ceramide nga gihimo sa mga yeast cell hangtod karon. Kini gi-synthesize sa ER ug kadaghanan niini gi-export sa Golgi apparatus pinaagi sa COPII vesicles (13). Ang ER export sa GPI-AP espesipikong nanginahanglan ug padayon nga ceramide synthesis (14, 15), ug sa baylo, ang pagkakabig sa ceramide ngadto sa inositol phosphate ceramide (IPC) sa Golgi apparatus nagdepende sa GPI anchor synthesis (16). Ang mga biophysical nga pagtuon nga adunay artipisyal nga mga lamad nagpakita nga ang taas kaayo nga acyl chain ceramides mahimong maghiusa aron maporma ang han-ay nga mga domain nga adunay talagsaon nga pisikal nga mga kabtangan (17, 18). Kini nga datos nagdala ngadto sa hypothesis nga ang C26 ceramide ug GPI-AP nga adunay C26 ceramide naggamit sa ilang pisikal nga mga kabtangan aron maghiusa ngadto sa han-ay nga mga rehiyon o rehiyon sa medyo gubot nga ER membrane lipid environment. Kini kasagaran gilangkoban sa mubo ug unsaturated glycerolipids (C16:1 ug C18:1) (19, 20). Kini nga mga rehiyon pilion nga naka-pokus sa piho nga mga ER exit site (ERES), diin ang ceramide ug ceramide-based GPI-AP mahimong madala uban sa Golgi sa parehas nga gipahinungod nga COPII vesicle (5).
Niini nga pagtuon, among direktang gisulayan kini nga mekanismo nga nakabase sa lipid pinaagi sa paggamit sa super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), nga usa ka cutting-edge microscopy technique nga dungan nga maka-obserbar sa mga fluorescently labeled protein. Ang tulo-ka-kolor ug tulo-ka-dimensional (3D) nga mga imahe adunay taas kaayo nga resolusyon ug katulin sa buhing mga selula (21, 22).
Una namong gigamit ang teknolohiya sa SCLIM aron mas matino kung giunsa ang normal nga GPI-AP nga adunay C26 ceramide group gi-screen gikan sa mga transmembrane secreted protein human mobiya sa ER sa S. cerevisiae. Aron masusi ang klasipikasyon sa ER, migamit kami og genetic system nga direktang maka-visualize sa bag-ong na-synthesize nga kargamento nga mosulod sa ERES in vivo (7, 23). Isip kargamento, among gipili ang C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 nga gi-label og green fluorescent protein (GFP) ug transmembrane secreted protein Mid2 nga gi-label og near-infrared fluorescent protein (iRFP), nga parehong nag-target sa plasma membrane (24–26). Sa sec31-1 temperature-sensitive mutant, kining duha ka kargamento gipahayag ubos sa galactose-inducible promoter ug usa ka constitutive ERES marker. Sa grabeng temperatura (37°C), tungod kay ang sec31-1 mutation makaapekto sa function sa COPII coat component nga Sec31 aron mapugngan ang pagtubo sa COPII ug pag-export sa ER, ang bag-ong na-synthesize nga kargamento magtigom sa ER (23). Human sa pagpabugnaw ngadto sa ubos nga temperatura (24°C), ang mga sec31-1 mutant cells nakabawi gikan sa secretory area, ug ang natipon nga bag-ong synthetic cargo nagsugod sa pag-eksport gikan sa ER. Ang CLIM visualization nagpakita nga kadaghanan sa bag-ong na-synthesize nga Gas1-GFP ug Mid2-iRFP natipon gihapon sa ER sa sec31-1 mutant cells human sa incubation sa 37°C ug dayon gibuhian sa 24°C sulod sa 5 ka minuto (Figure 1). Tungod kay ang Mid2-iRFP naapod-apod sa tibuok ER membrane, ug ang Gas1-GFP nakonsentrar ug natipon sa discontinuous ER membrane area, ang ilang distribusyon hingpit nga lahi (Figure 1, A hangtod C ug Movie S1). Dugang pa, sama sa gipakita sa Figure 1D, ang Gas1-GFP cluster walay Mid2-iRFP. Kini nga mga resulta nagpakita nga ang GPI-AP ug transmembrane proteins nabulag ngadto sa lain-laing mga rehiyon sa ER membrane sa sayo pa. Ang Gas1-GFP cluster kasikbit sa usa ka espesipikong ERES nga gimarkahan og mCherry's COPII coat protein nga Sec13 (Figure 1, E ug F, ug movie S1) (23).
Ang mga sec31-1 cells nagpahayag og mga galactose-induced secretions, usa ka taas nga acyl chain (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, berde) ug ang transmembrane protein Mid2-iRFP (TMP, asul) ug kini nga Constructive ERES labeling nga Sec13-mCherry (ERES, magenta) gi-incubate sa 37°C sulod sa 30 minutos, gibalhin ngadto sa 24°C, ug gi-image sa SCLIM 5 minutos ang milabay. Ang (A hangtod C) nagpakita sa usa ka representatibo nga gihiusa o single 2D nga imahe sa usa ka plane (A), usa ka 2D projection image sa 10 z-sections (B) o usa ka 3D cell hemisphere nga imahe sa cargo ug ERES markers (C). Scale bar 1μm (A ug B). Ang scale unit kay 0.551μm (C). Ang Gas1-GFP nakita sa discrete ER regions o clusters, samtang ang Mid2-iRFP nakita ug giapod-apod sa tibuok ER membrane (C). (D) Ang graph nagpakita sa relatibong fluorescence intensity sa Gas1-GFP ug Mid2-iRFP sa Gas1-GFP cluster subay sa puti nga linya sa pana (wala). AU, arbitrary unit. (E ug F) nagrepresentar sa 3D nga imahe nga naghiusa sa mga produkto ug marka sa ERES. Ang mga cluster sa Gas1-GFP nakita duol sa piho nga ERES. Ang scale unit kay 0.551μm. (F) Ang puti nga solidong pana nagtimaan sa Gas1-GFP cluster nga nalangkit sa ERES. Ang tunga ug tuo nga mga panel nagpakita sa gihiusa nga gipadako nga 3D nga imahe ug usa ka rotated view sa pinili nga Gas1-GFP cluster.
Ang suod nga spatial nga relasyon tali sa Gas1-GFP cluster ug usa ka piho nga ERES nagpakita nga ang Gas1-GFP makasulod sa selective ERES, nga lahi sa selectivity nga gigamit sa Mid2-iRFP aron mobiya sa ER. Aron matubag kini nga posibilidad, among gi-quantify ang ERES ratio para sa usa o duha lang ka mga produkto (Figure 2, A hangtod C). Among nakita nga kadaghanan sa ERES (70%) adunay usa lang ka klase sa kargamento. Ang ubos nga hulagway sa Figure 2C nagpakita sa duha ka tipikal nga ehemplo sa ERES nga adunay Gas1-GFP lamang (Figure 1) o Mid2-iRFP lamang (Figure 2). Sa kasukwahi, gibana-bana nga 20% sa ERES adunay duha ka kargamento nga nagsapaw sa parehas nga lugar. Nakita nga ang pipila ka ERES (10%) adunay duha ka klase sa kargamento, apan kini gilain sa klaro nga lainlaing mga lugar. Busa, kini nga statistical analysis nagpakita nga human ma-export ang ER, ang GPI-AP Gas1-GFP ug ang transmembrane cargo nga Mid2-iRFP gibahin sa lainlaing ERES (Figure 2D). Kini nga kahusayan sa pag-sort nahiuyon kaayo sa miaging biochemical analysis (6) ug morphological determination (7). Makita usab nato ang kinaiya sa quarantined cargo nga misulod sa ERES (Figure 2E ug Movie S2). Gipakita sa Figure 2E nga gamay ra nga bahin sa Gas1-GFP (panel 3) o Mid2-iRFP (panel 4) ang mosulod sa ERES gikan sa usa ka kilid ug natanggong sa usa ka discrete area. Gipakita sa Panel 5 sa Figure 2E nga ang Gas1-GFP ug Mid2-iRFP usahay makita sa parehas nga ERES, apan mosulod sila gikan sa lainlaing mga kilid ug natipon sa lainlaing mga rehiyon nga mahimong magrepresentar sa lainlaing mga COPII vesicle. Gikumpirma usab namo nga ang naobserbahan nga pagbulag ug klasipikasyon sa C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 isip selective ERES espesipiko tungod kay ang laing transmembrane secretion cargo, ang GFP-tagged plasma membrane protein nga Axl2 (27), nagpakita sa parehas nga kinaiya sa Mid2-iRFP. (Picture S1 ug Movie S3). Ang bag-ong na-synthesize nga Axl2-GFP giapod-apod pinaagi sa ER membrane sama sa Mid2-iRFP (Figure S1, A ug B), ug co-localized sa Mid2-iRFP sa kadaghanan sa ERES (Figure S1, B hangtod D). Ang mga Panel 1 ug 2 sa Figure 1. S1C nagpakita sa duha ka tipikal nga pananglitan sa ERES diin ang duha ka transmembrane cargoes nagsapaw. Niini nga mga kaso, ang duha ka produkto mosulod sa ERES nga magkauban (Figure S1E, Panel 3 ug Movie S3).
Ang mga sec31-1 cells nga nagpahayag sa galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) ug Mid2-iRFP (TMP, asul) ug constitutive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) gibutang sa 37. Human sa pag-incubate sulod sa 30 minutos sa °C, ibalhin ngadto sa 24 °C aron ipagawas ang secretion block, ug i-imahe gamit ang SCLIM human sa 20 minutos. (A hangtod C) Representative 2D projection images (A; scale bar, 1μm) o 3D cell hemisphere images (B ug C; scale unit, 0.456μm) sa cargo ug 10 z-sections nga gimarkahan og ERES. Ang ubos nga panel sa (B) ug ang panel sa (C) nagpakita sa mga giprosesong imahe aron ipakita lamang ang mga butang nga anaa sa ERES (magenta) [Gas1-GFP (gray) ug Mid2-iRFP (light blue)]. (C) Bukas nga pana: Ang ERES nagdala lamang og usa ka piraso sa cargo (1 hangtod 4). Abuhon nga pana: Ang ERES adunay gilain nga kargamento (5). Puti nga solidong pana: Ang ERES adunay co-located nga kargamento. Sa ubos: Ang napili nga single ERES adunay lamang Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Scale bar, 100 nm. (D) Kwantipikasyon sa photomicrograph nga gihulagway sa (C). Ang aberids nga porsyento sa ERES nga adunay lamang usa ka kargamento (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), gilain nga kargamento ug nagsapaw nga kargamento. Sa tulo ka independente nga mga eksperimento, n=432 sa 54 ka mga selula. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. *** P = 0.0002. (E) 3D nga imahe sa pinili nga ERES sa quarantined cargo nga gimarkahan og (C). Ang Gas1-GFP (berde) (3) o Mid2-iRFP (asul) (4) misulod sa ERES (magenta) gikan sa usa ka kilid ug limitado sa usa ka gamay nga lugar sulod sa ERES. Usahay, ang duha ka klase sa kargamento mosulod sa parehas nga ERES (5) gikan sa parehas nga kilid ug masulod sa usa ka hilit nga lugar sulod sa ERES. Scale bar, 100 nm.
Sunod, among gisulayan ang usa ka hypothesis nga ang taas nga acyl chain ceramide (C26) nga naa sa ER membrane ang nagduso sa piho nga clustering ug sorting sa Gas1 ngadto sa selective ERES. Tungod niini, migamit kami og giusab nga yeast strain nga GhLag1, diin ang duha ka endogenous ceramide synthases nga Lag1 ug Lac1 gipulihan sa GhLag1 (ang Lag1 homolog sa gapas), nga miresulta sa usa ka yeast strain nga adunay cell membrane nga Ceramide strain nga mas mubo kaysa wild type (Figure 3A) (28). Ang mass spectrometry (MS) analysis nagpakita nga sa wild-type strains, 95% sa kinatibuk-ang ceramide kay taas kaayo (C26) chain ceramide, samtang sa GhLag1, 85% sa ceramide kay taas kaayo (C18 ug C16). ), 2% ra sa ceramide ang taas kaayo (C26) chain ceramide. Bisan tuod ang C18 ug C16 ceramides mao ang pangunang ceramides nga nakita sa GhLag1 membrane hangtod karon, gikumpirma usab sa MS analysis nga ang GPI anchor sa Gas1-GFP nga gipahayag sa GhLag1 strain adunay C26 ceramide, nga ikatandi sa wild-type lipids. Parehas ra ang kalidad (Fig. 3A) (26). Busa, kini nagpasabot nga ang ceramide remodeling enzyme nga Cwh43 kay mapilion kaayo para sa C26 ceramide, sama sa gipakita sa Figure 26, mas gusto niini nga ilakip ang GPI anchor gikan sa gamay nga kantidad sa C26 ceramide sa GhLag1 strain. S2 (29). Bisan pa niana, ang cell membrane sa GhLag1 sa panguna adunay C18-C16 ceramide lamang, samtang ang Gas1-GFP adunay C26 ceramide gihapon. Kini nga kamatuoran naghimo niini nga strain nga usa ka sulundon nga himan aron espesipikong masulbad ang problema sa acyl chain length sa membrane ceramide sa ER. Ang hypothetical nga papel sa klase ug pag-sort. Dayon, among gitun-an una ang abilidad sa C26 Gas1-GFP nga magtigom sa mga cluster sa GhLag1 nga adunay temperature-sensitive mutant allele sa sec31-1 pinaagi sa conventional fluorescence microscopy, diin ang taas (C18-C16) chain lang ang anaa sa ER membrane nga Ceramide (Fig. 3). Among naobserbahan nga sa sec31-1, kadaghanan sa Gas1-GFP nakonsentrar sa mga cluster, samtang ang Gas1-GFP sa sec31-1 GhLag1 nga adunay taas (C18-C16) nga taas nga ceramide ER membrane wala kasagaran gipundok ug giapod-apod sa tibuok ER membrane. Aron mahimong tukma, tungod kay ang C26 ceramide-based clustering suod nga nalambigit sa piho nga ERES (Figure 1), among gisusi sunod kung kini nga proseso mahimo usab nga naglambigit sa function sa ER export protein mechanism. Ang GPI-AP naggamit ug espesyal nga COPII system para sa ER export, nga aktibo nga gi-regulate sa Ted1's structural remodeling sa glycan portion sa GPI anchor (30, 31). Ang recombinant nga GPI-glycan mailhan dayon sa transmembrane cargo receptor p24 complex, nga sa baylo mopili sa Lst1, nga usa ka piho nga isoform sa mayor nga COPII cargo binding subunit nga Sec24, nga nagporma og GPI-AP-rich COPII Vesicles (31-33). Busa, naghimo kami og double mutant nga naghiusa sa pagtangtang niining mga single protein (ang p24 complex component nga Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme nga Ted1 ug ang piho nga COPII subunit nga Lst1) uban sa sec31-1 mutant strain, ug gitun-an kini Posible ba nga maporma ang Gas1-cluster GFP (Figure 3). Among naobserbahan nga sa sec31-1emp24Δ ug sec31-1ted1Δ, ang Gas1-GFP kasagaran wala ma-cluster ug giapod-apod sa tibuok ER membrane, sama sa nakita kaniadto sa sec31-1 GhLag1, samtang sa sec31-1lst1Δ, ang Gas1-GFP Sama sa sec31-1. Kini nga mga resulta nagpakita nga dugang sa presensya sa C26 ceramide sa ER membrane, ang clustering sa Gas1-GFP kinahanglan usab nga mogapos sa p24 complex, ug wala magkinahanglan og espesipikong Lst1 recruitment. Dayon, among gisusi ang posibilidad nga ang gitas-on sa kadena sa ceramide sa ER membrane maka-regulate sa paggapos sa Gas1-GFP ngadto sa p24. Bisan pa, among nakita nga ang presensya sa C18-C16 ceramide sa membrane wala makaapekto sa GPI-glycans nga gi-reconstruct sa p24 complex (Figures S3 ug S4, A ug B) o paggapos sa GPI-AP ug pag-export sa GPI-AP. Pag-recruit sa COPII subtype Lst1 (Figure S4C). Busa, ang C26 ceramide-dependent clustering wala magkinahanglan og protein interactions nga adunay lain-laing ER export protein mechanisms, apan nagsuporta sa alternatibong sorting mechanism nga gimaneho sa gitas-on sa lipid. Dayon, among gisusi kung ang gitas-on sa ceramide acyl chain sa ER membrane importante ba alang sa epektibong klasipikasyon sa Gas1-GFP isip selective ERES. Tungod kay ang Gas1 sa GhLag1 strain nga adunay short-chain ceramide mobiya sa ER ug mosulod sa plasma membrane (Figure S5), nagtuo kami nga kung ang pag-sort gimaneho sa gitas-on sa ceramide acyl chain, ang Gas1 sa GhLag1 strain mahimong i-redirect ug i-cross. Ang ERES nga mga produkto nga adunay parehas nga membrane.
(A) Ang cell membrane sa GhLag1 kasagaran adunay mas mubo nga C18-C16 ceramides, samtang ang GPI anchor sa Gas1-GFP adunay parehas nga C26 IPC sama sa wild-type cells. Sa ibabaw: pag-analisa sa gitas-on sa acyl chain sa ceramide sa cell membrane sa wild-type (Wt) ug GhLag1p strains pinaagi sa mass spectrometry (MS). Ang datos nagrepresentar sa porsyento sa kinatibuk-ang ceramide. Ang aberids sa tulo ka independente nga mga eksperimento. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. **** P <0.0001. Ubos nga panel: MS analysis sa gitas-on sa acyl chain sa IPC nga anaa sa Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI anchor nga gipahayag sa wild-type ug GhLag1p strains. Ang datos nagrepresentar sa porsyento sa kinatibuk-ang IPC signal. Aberids sa lima ka independente nga mga eksperimento. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. ns, dili importante. P = 0.9134. (B) Ang mga fluorescence micrograph sa sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ug sec31-1lst1Δ nga mga selula nga nagpahayag sa galactose-induced Gas1-GFP gi-incubate sa 37°C sulod sa 30 minutos ug gipasa aron Ipahigayon ang routine fluorescence microscopy human sa 24°C. Puti nga pana: ER Gas1-GFP cluster. Bukas nga pana: Ang Unclustered Gas1-GFP giapod-apod sa tibuok ER membrane, nga nagpakita sa ER characteristic nuclear ring staining. Scale bar, 5μm. (C) Kwantipikasyon sa photomicrograph nga gihulagway sa (B). Ang aberids nga porsyento sa mga selula nga adunay punctate Gas1-GFP nga istruktura. Sa tulo ka independente nga mga eksperimento, n≥300 ka mga selula. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. **** P <0.0001.
Aron direktang masulbad kini nga problema, among gihimo ang SCLIM visualization sa Gas1-GFP ug Mid2-iRFP sa GhLag1 nga adunay sec31-1 temperature-sensitive mutant allele (Figure 4 ug Movie S4). Human ang ER gipabilin sa 37°C ug dayon gipagawas sa 24°C, kadaghanan sa bag-ong na-synthesize nga Gas1-GFP wala mapundok ug wala maapod-apod sa tibuok ER membrane, sama sa naobserbahan sa conventional microscopes (Figure 4, A ug B). Dugang pa, ang dakong porsyento sa ERES (67%) naglakip sa duha ka klase sa cargo nga nahimutang niini (Figure 4D). Ang mga panel 1 ug 2 sa Figure 4C nagpakita sa duha ka tipikal nga ehemplo sa ERES nga adunay nagsapaw nga Gas1-GFP ug Mid2-GFP. Dugang pa, ang duha ka produkto girekrut sa parehas nga ERES (Figure 4E, panel 3 ug movie S4). Busa, ang among mga resulta nagpakita nga ang gitas-on sa ceramide acyl chain sa ER membrane usa ka importante nga determinant sa ER protein aggregation ug classification.
Ang mga selula sa Sec31-1 GhLag1 nga nagpahayag sa mga sekresyon nga gipahinabo sa galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) ug Mid2-iRFP (TMP, asul) ug constitutive ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) I-incubate sa 37°C. Ipadayon sulod sa 30 minutos, ipaubos ngadto sa 24°C aron mopagawas sa mga sekresyon, ug kuhaa ang imahe gamit ang SCLIM human sa 20 minutos. (A hangtod C) Representative 2D projection images (A; scale bar, 1μm) o 3D cell hemisphere images (B ug C; scale unit, 0.45μm) sa 10 ka z-sections nga gimarkahan sa cargo ug ERES. Ang ubos nga panel sa (B) ug ang panel sa (C) nagpakita sa mga giproseso nga imahe aron ipakita lamang ang mga produkto nga anaa sa ERES (magenta) [Gas1-GFP (gray) ug Mid2-iRFP (light blue)]. (C) Puti nga puno nga pana: ERES, ang mga produkto nagsapaw. Bukas nga pana: Ang ERES adunay usa ra ka butang. Ubos nga panel: Ang napili nga ERES adunay nagsapaw nga mga butang (1 ug 2) nga gimarkahan sa (C). Scale bar, 100 nm. (D) Kwantipikasyon sa photomicrograph nga gihulagway sa (C). Sa sec31-1 ug sec31-1 GhLag1 units, usa ra ka kargamento (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) ang gilakip, ug ang aberids nga porsyento sa ERES para sa nahimulag nga kargamento ug nagsapaw nga kargamento. Sa tulo ka independente nga mga eksperimento, n = 432 sa 54 ka mga selula (sec31-1) ug n = 430 sa 47 ka mga selula (sec31-1 GhLag1). Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. *** P = 0.0002 (sec31-1) ug ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D nga imahe sa napili nga ERES nga adunay nagsapaw nga kargamento (3) nga gimarkahan sa (C). Ang Gas1-GFP (berde) ug Mid2-iRFP (asul) moduol sa ERES (magenta) gikan sa samang kilid ug magpabilin sa samang ERES restricted area. Scale bar, 100 nm.
Kini nga pagtuon naghatag direkta nga in vivo nga ebidensya nga ang mga lipid-based protein cargoes giklasipikar ngadto sa selective export sites sa secretory pathway, ug nagpadayag sa kamahinungdanon sa acyl chain length para sa classification selectivity. Gamit ang usa ka gamhanan ug cutting-edge microscopy technique nga gitawag og SCLIM, among gipakita ang bag-ong na-synthesize nga Gas1-GFP (usa ka mayor nga plasma membrane GPI-AP nga adunay taas kaayo nga acyl chain (C26) ceramide lipid portion) sa yeast) Ang mga rehiyon nga gipundok sa discrete ERs nalangkit sa piho nga ERES, samtang ang transmembrane secreted proteins giapod-apod sa tibuok ER membrane (Figure 1). Dugang pa, kini nga duha ka klase sa mga produkto mosulod sa lain-laing ERES nga selectively (Figure 2). Ang acyl chain length sa cellular ceramide sa membrane mikunhod gikan sa C26 ngadto sa C18-C16, ang Gas1-GFP cluster nabungkag ngadto sa discrete ER region, ug ang Gas1-GFP gi-reroute aron mobiya sa ER uban sa transmembrane protein pinaagi sa parehas nga ERES (Figure 3 ug Figure 3). 4).
Bisan tuod ang GPI-AP naggamit ug espesyalisadong mekanismo sa protina aron mogawas sa ER, among nakita nga ang C26 ceramide-dependent separation wala magsalig sa lain-laing interaksyon sa protina nga mahimong mosangpot sa espesyalisasyon sa ERES (Mga Figure S4 ug S5). Hinuon, ang among mga nahibal-an nagsuporta sa alternatibong mekanismo sa klasipikasyon nga gimaneho sa lipid-based protein clustering ug sunod nga pag-eksklude sa ubang mga kargamento. Ang among mga obserbasyon nagpakita nga ang rehiyon o cluster sa Gas1-GFP nga nalangkit sa usa ka piho nga ERES kulang sa transmembrane secreted protein nga Mid2-iRFP, nga nagpakita nga ang C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster mopasayon ​​sa ilang pagsulod sa may kalabutan nga ERES, ug sa samang higayon, dili iapil ang transmembrane secretions nga mosulod niining partikular nga ERES (Mga Figure 1 ug 2). Sa kasukwahi, ang presensya sa C18-C16 ceramides sa ER membrane dili hinungdan nga ang GPI-AP moporma og mga rehiyon o cluster, busa dili nila iapil o ilisan ang transmembrane secreted proteins ngadto sa parehas nga ERES (Mga Figure 3 ug 4). Busa, among gisugyot nga ang C26 ceramide maoy mopadali sa pagbulag ug klasipikasyon pinaagi sa pagpadali sa pagpundok sa mga protina nga nalambigit sa espesipikong ERES.
Unsaon pagkab-ot niining C26 ceramide-dependent clustering ngadto sa usa ka piho nga ER area? Ang tendensiya sa membrane ceramide nga magbulag sa kilid mahimong hinungdan sa GPI-AP ug C26 ceramide nga maporma ang gagmay ug diha-diha dayon nga han-ay nga mga lipid sa mas dili regular nga palibot sa lipid sa ER membrane nga adunay mas mubo ug unsaturated glycerolipids. Mga kalidad nga cluster (17, 18). Kining gagmay nga temporaryo nga mga cluster mahimong dugang nga i-fuse ngadto sa mas dagko, mas lig-on nga mga cluster human sa pagbugkos sa p24 complex (34). Subay niini, among gipakita nga ang C26 Gas1-GFP kinahanglan nga makig-uban sa p24 complex aron maporma ang mas dagkong makita nga mga cluster (Figure 3). Ang p24 complex usa ka heterozygous oligomer nga gilangkoban sa upat ka lain-laing p24 transmembrane proteins sa yeast (35), nga naghatag og multivalent binding, nga mahimong mosangpot sa cross-linking sa gagmay nga GPI-AP clusters, sa ingon makamugna og mas dako nga Stable cluster (34). Ang interaksyon tali sa mga protein ectodomain sa GPI-APs mahimo usab nga makatampo sa ilang aggregation, sama sa gipakita atol sa ilang Golgi transport sa mammalian polarized epithelial cells (36). Bisan pa, kung ang C18-C16 ceramide anaa sa ER membrane, kung ang p24 complex motapot sa Gas1-GFP, ang dagkong managlahing clusters dili maporma. Ang nagpahiping mekanismo mahimong magdepende sa piho nga pisikal ug kemikal nga mga kabtangan sa taas nga acyl chain ceramide. Ang biophysical nga mga pagtuon sa artipisyal nga mga lamad nagpakita nga bisan kung ang taas (C24) ug mubo (C18-C16) acyl chain ceramides mahimong hinungdan sa phase separation, ang taas nga acyl chain ceramides (C24) lamang ang makapalambo sa taas nga Curvature ug film bending aron mabag-o ang film. Pinaagi sa mutual reference (17, 37, 38). Gipakita nga ang transmembrane helix sa TMED2, ang homologue sa tawo sa Emp24, pilion nga nakig-uban sa C18 ceramide-based sphingomyelin sa cytoplasmic lobules (39). Gamit ang mga simulation sa molecular dynamics (MD), among nakita nga ang C18 ug C26 ceramides parehong nagtigom sa palibot sa cytoplasmic lobules sa Emp24 transmembrane helix, ug parehas silag gusto (Figure S6). Angayan nga matikdan nga kini nagpakita nga ang transmembrane helix sa Emp24 mahimong mosangpot sa asymmetric distribution sa mga lipid sa membrane. Kini usa ka bag-o nga resulta base sa mga selula sa mammalian. Ang susamang MD simulations nagpakita usab sa presensya sa ether lipids (40). Busa, among gihunahuna nga ang C26 ceramide sa duha ka lobules sa ER26 kay locally enriched. Kung ang GPI-AP sa luminal lobules direktang motapot sa multivalent p24 ug ang pagtapok sa C26 ceramide sa palibot sa p24 sa cytoplasmic lobules, kini makapalambo sa kaubang Protein aggregation ug membrane curvature nga namugna pinaagi sa mga tudlo (41), hinungdan nga ang GPI-AP mobulag ngadto sa discrete nga mga rehiyon nga kasikbit sa ERES, nga pabor usab sa highly curved nga mga rehiyon sa ER membrane (42). Ang mga nangaging report misuporta sa gisugyot nga mekanismo (43, 44). Ang multivalent binding sa oligolectins, pathogens o antibodies sa ceramide-based glycosphingolipids (GSL) sa plasma membrane nag-trigger sa dako nga GSL aggregation, nagpalambo sa phase separation ug hinungdan sa membrane deformation ug internalization (44). Iwabuchi etc. (43) Nakaplagan nga sa presensya sa taas (C24) apan dili mubo (C16) acyl chains, ang multivalent ligand nga gigapos sa GSL lactosylceramide nag-induce sa pagporma sa dagkong mga cluster ug membrane invagination, ug ang cytoplasm Lyn-mediated signal transduction sa mga leaflet gi-interdigitate sa acyl chains sa coupled neutrophils.
Sa mga mammalian polarized epithelial cells, ang konsentrasyon sa anti-Golgi network (TGN) hangtod sa lebel sa apical plasma membrane nagkontrol sa pagbulag ug pag-sort sa GPI-AP (10, 45). Kini nga aggregation gimaneho sa GPI-AP oligomerization (36), apan mahimo usab kini nga magdepende sa gitas-on sa ceramide chain nga atong makit-an sa yeast. Bisan kung ang mammalian GPI-AP adunay ether lipid-based anchor, ug ang kemikal nga istruktura niini lahi kaayo sa taas kaayo nga acyl chain ceramide, usa ka bag-o nga pagtuon ang nakit-an nga ang duha ka lipid adunay parehas nga ebolusyonaryong pisikal ug kemikal nga mga kabtangan ug function (40). Busa, ang ether lipid nga bahin sa mga mammalian cells mahimong parehas sa C26 ceramide sa yeast, ug ang papel niini mao ang pag-associate sa long-chain ceramide sa membrane aron mapalambo ang GPI-AP aggregation ug sorting. Bisan kung kini nga posibilidad kinahanglan pa nga sulayan direkta, ang nangaging mga nahibal-an nagsuporta nga ang pagdala sa taas nga acyl chain ceramide sa Golgi body wala gihimo sa cytoplasmic transfer proteins, apan nagdepende sa synthesis sa GPI anchors sama sa yeast. Busa, ang mekanismo sa ebolusyonaryong konserbatibo daw makahimo sa pagpili nga mag-co-transport sa taas kaayo nga acyl chain ceramide ug GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) sa parehas nga transport vesicle.
Sa yeast ug mammalian polarized epithelial cell systems, ang GPI-AP aggregation ug separation gikan sa ubang plasma membrane proteins tanan mahitabo sa dili pa makaabot sa cell surface. Nakita ni Paladino et al. (48) nga sa TGN sa mammalian polarized epithelial cells, ang GPI-AP clustering dili lamang gikinahanglan alang sa selective classification sa GPI-APs ngadto sa apical plasma membrane, apan nag-regulate usab sa clustering organization sa GPI-APs ug sa biological activity niini. Cell surface. Sa yeast, kini nga pagtuon nagpakita nga ang C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster sa ER maka-regulate sa cluster organization ug functional activity sa GPI-AP sa plasma membrane (24, 49). Subay niini nga modelo, ang GhLag1 cells alerdyik sa GPI inhibitors o mga tambal nga makaapekto sa cell wall integrity (28), ug ang panginahanglan alang sa functional Gas1-GFP clusters (49) sa tip ceramide nga gi-project sa mating sa yeast cells nagpakita sa G​​​ Posibleng physiological consequences sa hLag1 cells. GPI-AP error. Apan, ang dugang pagsulay kung ang functional organization sa cell surface na-program ba gikan sa ER pinaagi sa sorting method base sa lipid length mao ang hisgutan sa among umaabot nga panukiduki.
Ang mga strain sa Saccharomyces cerevisiae nga gigamit niini nga trabaho gilista sa Table S1. Ang mga strain sa MMY1583 ug MMY1635 sa SCLIM para sa live cell imaging gihimo sa background sa W303. Kini nga mga strain nga nagpahayag sa Sec13-mCherry nga adunay fluorescent protein tag gihimo gamit ang polymerase chain reaction (PCR)-based nga pamaagi nga adunay pFA6a plasmid isip template (23). Ang strain nga nagpahayag sa Mid2-iRFP nga gimarkahan og fluorescent protein ubos sa kontrol sa GAL1 promoter gihimo sama sa mosunod. PCR amplification sa iRFP-KanMx sequence gikan sa pKTiRFP-KAN vector (regalo ni E. O'Shea, Addgene plasmid number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; research resource identifier (RRID): Addgene_64687) Ug gisulod sa C-terminus sa endogenous Mid2. Human ma-amplify ug ma-clone ang Mid2-iRFP genome sequence ngadto sa GAL1 promoter, kini gi-integrate ngadto sa Not I-Sac I site sa integration plasmid pRS306. Ang resulta nga plasmid pRGS7 gi-linearize uban sa Pst I aron ma-integrate ngadto sa URA3 locus.
Ang Gas1-GFP fusion gene gipahayag ubos sa kontrol sa GAL1 promoter sa centromere (CEN) plasmid, nga gihimo sama sa mosunod. Ang Gas1-GFP sequence gi-amplify pinaagi sa PCR gikan sa pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (gift of L. Popolo) ug gi-clone ngadto sa Xma I–Xho I site sa CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (gift of C). Miller; Addgene plasmid number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Ang resulta nga plasmid ginganlan og pRGS6. Ang Axl2-GFP fusion gene gipahayag usab ubos sa kontrol sa GAL1 promoter sa pBEVY-GL LEU2 vector, ug ang pagkagama niini mao ang mosunod. Ang Axl2-GFP sequence gi-amplify gikan sa pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) pinaagi sa PCR, ug gi-clone ngadto sa Bam HI-Pst I site sa pBEVY-GL LEU2 vector. Ang resulta nga plasmid ginganlan og pRGS12. Ang sequence sa oligonucleotides nga gigamit niini nga pagtuon gilista sa Table S2.
Ang strain gisuplementohan og 0.2% adenine ug 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] rich yeast extract protein p (YP) medium (1% Yeast extract ug 2% protein ept). (YPR)] o 2% galactose [YP-galactose (YPG)] isip carbon source, o sa synthetic minimal medium (0.15% yeast nitrogen base ug 0.5% ammonium sulfate) aron madugangan ang angay nga amino acids ug bases nga gikinahanglan para sa nutrisyon, ug adunay 2% glucose (synthetic glucose minimal medium) o 2% galactose (synthetic galactose minimal medium) isip carbon source.
Para sa real-time imaging, ang mga temperature-sensitive sec31-1 mutant cells nga nagpahayag sa construct ubos sa GAL1 promoter gipatubo sa YPR medium sa 24°C sa tibuok gabii hangtod sa mid-log phase. Human sa induction sa YPG sa 24°C sulod sa 1 ka oras, ang mga cells gi-incubate sa SG sa 37°C sulod sa 30 minutos, ug dayon gibalhin ngadto sa 24°C aron mogawas gikan sa secretion block. Gigamit ang Concanavalin A aron ayohon ang mga cells sa usa ka glass slide ug gi-image pinaagi sa SCLIM. Ang SCLIM usa ka kombinasyon sa Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope ug UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus), high-speed ug high-signal-to-noise ratio rotating disc confocal scanner (Yokogawa Electric), custom spectrometer, ug custom cooling. Ang image intensifier sa sistema (Hamamatsu Photonics) makahatag og magnifying lens system nga adunay final magnification nga ×266.7 ug usa ka charge-coupled device camera nga mopadaghan sa mga electron (Hamamatsu Photonics) (21). Ang pagkuha og imahe gihimo pinaagi sa custom software (Yokogawa Electric). Para sa 3D nga mga imahe, migamit kami og custom-made piezoelectric actuator aron i-vibrate ang objective lens nga patindog, ug gikolekta ang optical parts nga 100 nm ang gilay-on sa usa ka stack. Ang Z-stack nga imahe gi-convert ngadto sa 3D voxel data, ug ang theoretical point spread function nga gigamit para sa rotating disc confocal microscope gigamit para sa deconvolution processing pinaagi sa Volocity software (PerkinElmer). Pinaagi sa paggamit sa Volocity software aron awtomatikong mag-threshold para sa co-location analysis, gisukod ang ERES lakip ang kargamento. Ang line scan analysis gihimo gamit ang MetaMorph software (Molecular Devices).
Gamita ang GraphPad Prism software aron mahibal-an ang statistical significance. Para sa two-tailed Student's t-test ug sa ordinary one-way analysis of variance (ANOVA) test, ang mga kalainan tali sa mga grupo giisip nga adunay dakong epekto sa P <0.05 (*).
Para sa fluorescence microscopy sa Gas1-GFP, ang mga log phase cells gipatubo sa tibuok gabii sa YPD ug gikolekta pinaagi sa centrifugation, gihugasan kaduha gamit ang phosphate buffered saline, ug gi-incubate sa yelo sulod sa labing menos 15 ka minuto, ug dayon gipadayon ubos sa microscope sama sa gihulagway kaniadto. Susiha (24). Ang Leica DMi8 microscope (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) nga adunay objective lens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu camera ug Application Suite X (LAS X) software gigamit para sa acquisition.
Ang mga sample gi-denatured gamit ang SDS sample buffer sa 65°C sulod sa 10 ka minuto, ug dayon gibulag pinaagi sa SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Para sa immunoblotting analysis, 10 μl nga sample ang gi-load kada lane. Pangunang antibody: Gamita ang rabbit polyclonal anti-Gas1 sa dilution nga 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 sa dilution nga 1:500, ug rabbit polyclonal anti-GFP (regalo gikan ni H. Riezman) sa dilution nga 1:3000. Ang mouse monoclonal anti-Pgk1 antibody gigamit sa dilution nga 1:5000 (regalo gikan ni J. de la Cruz). Ikaduhang antibody: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) nga gigamit sa dilution nga 1:3000 (Pierce). Ang HRP-conjugated goat anti-mouse IgG gigamit sa dilution nga 1:3000 (Pierce). Ang immune response zone naobserbahan pinaagi sa chemiluminescence method sa SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Sama sa gihulagway sa (31), usa ka natural immunoprecipitation experiment ang gihimo sa enriched ER fraction. Sa laktod nga pagkasulti, hugasi ang yeast cells gamit ang TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ug protease inhibitor mixture) sa 600 nm (OD600) sa 100 optical density kaduha. Gibuak kini gamit ang glass beads, ug dayon ang mga debris sa cell ug glass beads gikuha pinaagi sa centrifugation. Ang supernatant gi-centrifugate dayon sa 17,000 g sulod sa 15 minutos sa 4°C. Ang pellet gi-resuspend sa TNE ug ang digitalis saponin gidugang sa katapusang konsentrasyon nga 1%. Ang suspension gi-incubate sulod sa 1 ka oras nga adunay rotation sa 4°C, ug dayon ang dili matunaw nga mga sangkap gikuha pinaagi sa centrifugation sa 13,000 g sa 4°C sulod sa 60 minutos. Para sa Gas1-GFP immunoprecipitation, una i-pre-incubate ang sample gamit ang walay sulod nga agarose beads (ChromoTek) sa 4°C sulod sa 1 ka oras, ug dayon i-incubate gamit ang GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C sulod sa 3 ka oras. Ang mga immunoprecipitated beads gihugasan sa lima ka beses gamit ang TNE nga adunay 0.2% digoxigenin, gi-elute gamit ang SDS sample buffer, gibulag sa SDS-PAGE, ug gi-analisa pinaagi sa immunoblotting.
Sama sa gihulagway sa (31), ang cross-linking determination gihimo sa enriched ER fraction. Sa laktod nga pagkasulti, ang enriched ER fraction gi-incubate sa 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Ang crosslinking reaction gipalong pinaagi sa pagdugang og glycine (50 mM final concentration, 5 minutos, 20°C).
Sama sa gihulagway kaniadto (50), gihimo ang MS analysis sa ceramide sa wild-type ug GhLag1 strains. Sa laktod nga pagkasulti, ang mga selula gipatubo ngadto sa exponential phase (3 ngadto sa 4 OD600 units/ml) sa YPD sa 30°C, ug 25×107 ka selula ang gi-ani. Ang ilang metabolismo gipalong gamit ang trichloroacetic acid. Gamita ang extraction solvent [ethanol, tubig, ether, pyridine ug 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] ug 1.2 nmol sa internal standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) quality). Gamita ang monomethylamine reagent [methanol, tubig, n-butanol ug methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] aron paghimo og mild alkaline hydrolysis sa extract, ug dayon gamita ang water-saturated n-butanol aron ma-desalt. Sa katapusan, ang extract gi-resuspend sa usa ka positive mode solvent [chloroform/methanol/tubig (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] ug gi-inject sa mass spectrometer. Gihimo ang multi-reaction monitoring (MRM) para sa pag-ila ug pag-quantify sa mga sphingolipid molecule. Ang TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) adunay robotic nanoflow ion source nga Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para sa lipid analysis. Ang collision energy gi-optimize para sa matag ceramide category. Ang MS data nakuha sa positive mode. Para sa matag biological replicate, ang lipid signal mao ang median sa tulo ka independent measurements.
Sama sa gihulagway sa (31), ang mga selula (800×107) nga nagpahayag sa Gas1-GFP gipailalom sa natural nga immunoprecipitation. Ang giputli nga Gas1-GFP gibulag pinaagi sa SDS-PAGE ug gibalhin ngadto sa usa ka polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Ang protina gi-visualize pinaagi sa pagtina sa PVDF gamit ang amide black. Ang Gas1-GFP band giputol gikan sa PVDF ug gihugasan sa 5 ka beses gamit ang methanol ug kausa gamit ang liquid chromatography-MS (LC-MS) grade nga tubig. Pinaagi sa pag-incubate sa membrane strip gamit ang 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer ug 500μl nga bag-ong natunaw nga 1 M sodium nitrite mixture sa 37°C sulod sa 3 ka oras, ang lipid fraction gipagawas gikan sa Gas1-GFP ug gi-lyse. Ang pagpagawas sa inosine phosphate ceramide tali sa glucosamine ug inositol (51). Human niana, ang membrane strip gihugasan upat ka beses gamit ang LC-MS grade nga tubig, gipauga sa temperatura sa kwarto, ug gitipigan sa nitrogen atmosphere sa -80°C hangtod sa pag-analisa. Isip kontrol, usa ka blangko nga sample sa PVDF membrane ang gigamit alang sa matag eksperimento. Ang lipid nga gikuha gikan sa Gas1-GFP gi-analisa dayon sa MS sama sa gihulagway (50). Sa laktod nga pagkasulti, ang mga PVDF strip nga adunay GPI-lipid gi-resuspend sa 75μl nga negative mold solvent [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] ug gipasa ang electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis sa sphingolipid species (TSQ Vantage). Niini nga kaso, ang datos sa MS nakuha sa negative ion mode.
Sama sa nahisgotan na, ang lipid nga bahin sa GPI anchor gibulag gikan sa [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Ang mga lipid gibulag pinaagi sa thin-layer chromatography gamit ang solvent system (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) ug gi-visualize gamit ang FLA-7000 (Fujifilm).
Ang mga selula nga nagpahayag sa Gas1-GFP (600×107) gihugasan kaduha gamit ang TNE buffer nga adunay TNE buffer, ug gibuak gamit ang glass beads, ug dayon gi-centrifuge aron makuha ang mga debris sa selula ug glass beads. Ang supernatant gi-centrifuge dayon sa 17,000 g sulod sa 1 ka oras sa 4°C. Ang pellet gihugasan sa TNE ug gi-incubate gamit ang 1 U PI-PLC (Invitrogen) sa TNE nga adunay 0.2% digitalis saponin sulod sa 1 ka oras sa 37°C. Human sa enzyme treatment, ang membrane gikuha pinaagi sa centrifugation sa 17,000 g sa 4°C sulod sa 1 ka oras. Aron ma-immunoprecipitate ang Gas1-GFP, ang supernatant gi-incubate gamit ang GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C sa tibuok gabii. Ang giputli nga Gas1-GFP nga gibulag sa SDS-PAGE gipintalan gamit ang Coomassie brilliant blue. Ang Gas1-GFP staining band giputol gikan sa abuhon nga naglibot sa aqueduct, ug dayon human sa alkylation gamit ang iodoacetamide ug reduction gamit ang dithiothreitol, gihimo ang in-gel digestion gamit ang trypsin. I-extract ug i-dry ang tryptic peptides ug peptides gamit ang GPI-glycans. Ang uga nga peptide gitunaw sa 20 μl nga tubig. I-inject ang usa ka bahin (8μl) ngadto sa LC. Usa ka octadecylsilane (ODS) column (Develosil 300ODS-HG-5; inner diameter 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) ang gigamit sa pagbulag sa mga peptide ubos sa espesipikong gradient conditions. Ang mobile phase mao ang solvent A (0.08% formic acid) ug solvent B (0.15% formic acid sa 80% acetonitrile). Usa ka Accela HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ang gigamit sa pag-elute sa column gamit ang solvent A sulod sa 55 minutos sa flow rate nga 50 μl min-1 sulod sa 5 minutos, ug dayon ang konsentrasyon sa solvent B gipataas ngadto sa 40%. , Estados Unidos). Ang eluate padayon nga gipaila ngadto sa ESI ion source, ug ang tryptic peptides ug peptides nga adunay GPI-glycans gi-analisa gamit ang LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Sa MS setup, ang boltahe sa capillary source gibutang sa 4.5 kV, ug ang temperatura sa transfer capillary gipadayon sa 300°C. Ang capillary voltage ug tube lens voltage gibutang sa 15 V ug 50 V, matag usa. Ang datos sa MS nakuha sa positive ion mode (resolusyon nga 60,000; katukma sa masa nga 10 ka bahin kada milyon) sa usa ka range sa masa nga 300/m/z mass/charge ratio (m/z) 3000. Ang datos sa MS/MS nakuha pinaagi sa ion trap sa LTQ Orbitrap XL [ang unang 3 ka digit diin nagdepende ang datos, collision induced dissociation (CID)].
Ang mga MD simulation gihimo gamit ang GROMACS (52) software ug MARTINI 2 force field (53-55). Ang CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) gigamit dayon sa paghimo og bilayer nga adunay dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) ug Cer C18 o DOPC ug Cer C26. Ang topology ug mga coordinate sa Cer C26 gikuha gikan sa DXCE pinaagi sa pagtangtang sa dugang nga mga beads gikan sa sphingosine tail. Gamita ang proseso nga gihulagway sa ubos aron mabalanse ang double layer ug ipadagan kini, dayon gamita ang katapusang mga coordinate sa sistema aron paghimo og sistema nga adunay Emp24. Ang transmembrane domain sa yeast Emp24 (mga residue 173 hangtod 193) gitukod isip α-helix gamit ang visual MD (VMD) tool molecular structure (58). Dayon, human makuha ang nagsapaw-sapaw nga mga lipid, ang protina gi-granular pag-ayo ug gisulod sa bilayer gamit ang CHARMM GUI. Ang katapusang sistema adunay sulod nga 1202 DOPC ug 302 Cer C26 o 1197 DOPC ug 295 Cer C18 ug Emp24. I-ionize ang sistema ngadto sa konsentrasyon nga 0.150M. Upat ka independente nga replika ang gihimo para sa duha ka bilayer nga komposisyon.
Ang lipid bilayer gibalanse gamit ang proseso sa CHARMM GUI, nga naglambigit sa pagminus ug dayon pagbalanse sa 405,000 ka mga lakang, diin ang mga limitasyon sa posisyon hinay-hinay nga gipakunhod ug giwagtang, ug ang time step gipataas gikan sa 0.005 ps ngadto sa 0.02 ps. Human sa equilibration, kini makamugna og 6 µs nga adunay time step nga 0.02 ps. Human sa pagsal-ot sa Emp24, gamita ang parehas nga proseso sa CHARMM GUI aron maminusan ug mabalanse ang sistema, ug dayon padaganon sulod sa 8 s sa produksiyon.
Alang sa tanang sistema, atol sa proseso sa pagbalanse, ang presyur gikontrol sa Berendsen barostat (59), ug atol sa proseso sa produksiyon, ang presyur gikontrol sa Parrinello-Rahman barostat (60). Sa tanang kaso, ang aberids nga presyur kay 1 bar ug usa ka semi-isotropic pressure coupling scheme ang gigamit. Sa proseso sa pagbalanse ug produksiyon, usa ka thermostat (61) nga adunay speed recalibration ang gigamit aron i-couple ang temperatura sa protina, lipid ug solvent particles matag usa. Atol sa tibuok operasyon, ang target nga temperatura kay 310K. Ang non-bonding interaction gikalkulo pinaagi sa pagmugna og pairing list gamit ang Verlet scheme nga adunay 0.005 buffer tolerance. Ang Coulomb term gikalkulo gamit ang reaction field ug cut-off distance nga 1.1 nm. Ang Vander Waals term naggamit og cut-off scheme nga adunay cut-off distance nga 1.1 nm, ug ang Verlet cut-off scheme gigamit para sa potential drift (62).
Gamit ang VMD, ang cutoff wavelength tali sa DOPC phosphate beads o ceramide AM1 beads ug sa protina kay 0.7 nm, ug ang gidaghanon sa mga lipid nga nakig-interact sa protina gikalkulo. Sumala sa mosunod nga pormula, kwentaha ang depletion-enrichment (DE) factor sama sa (63): DE factor = (ang gidaghanon sa kinatibuk-ang lipids sa protina 0.7) sa protina 0.7 (ang gidaghanon sa Cer sa kinatibuk-ang lipids)
Ang gitaho nga bili makuha isip aberids, ug ang mga error bar kay upat ka independente nga kopya sa SE. Ang statistical significance sa DE factor gikalkulo pinaagi sa t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Kwentaha ang P value gikan sa one-tailed distribution.
Ang GROMACS tool gigamit aron makalkulo ang 2D lateral density map sa sistema nga adunay Emp24 sulod sa katapusang 250 ns sa trace. Aron makuha ang enrichment/depletion map sa ceramide, ang density map sa Cer gibahin sa suma sa map sa Cer ug DOPC, ug dayon gibahin sa konsentrasyon sa Cer sa lawas. Ang parehas nga color map scale ang gigamit.
Para sa dugang nga mga materyales para niining artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Kini usa ka open access nga artikulo nga giapod-apod ubos sa mga termino sa Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike License, nga nagtugot sa paggamit, pag-apod-apod, ug pagpatik pag-usab sa bisan unsang medium, basta ang katapusang paggamit dili alang sa komersyal nga ganansya ug ang premise mao nga ang orihinal nga buhat husto. Reperensya.
Pahinumdom: Among gihangyo lang nga ihatag nimo ang imong email address aron ang tawo nga imong girekomenda sa panid mahibalo nga gusto nimo nga makita nila ang email ug nga dili kini spam. Dili kami mokuha og bisan unsang email address.
Kini nga pangutana gigamit aron pagsulay kung ikaw usa ka bisita ug mapugngan ang awtomatikong pagsumite sa spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ang 3D high-resolution real-time imaging nagpadayag sa kamahinungdanon sa gitas-on sa ceramide chain para sa pag-sort sa protina sa mga selective output sites.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ang 3D high-resolution real-time imaging nagpadayag sa kamahinungdanon sa gitas-on sa ceramide chain para sa pag-sort sa protina sa mga selective output sites.
©2020 American Association for the Advancement of Science. ang tanan nga mga katungod gigahin. Ang AAAS kauban sa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ug COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.