Among gitaho kaniadto nga ang lebel sa serum sa gut-derived tryptophan metabolite nga indole-3-propionic acid (IPA) mas ubos sa mga pasyente nga adunay liver fibrosis. Niini nga pagtuon, among gisusi ang transcriptome ug DNA methylome sa mga tambok nga atay kalabot sa lebel sa serum IPA, ingon man ang papel sa IPA sa pag-induce sa phenotypic inactivation sa hepatic stellate cells (HSCs) in vitro.
Ang pagtuon naglakip sa 116 ka mga pasyente nga tambok nga walay type 2 diabetes mellitus (T2DM) (edad 46.8 ± 9.3 ka tuig; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) nga gipailalom sa bariatric surgery sa Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). Ang nag-circulate nga lebel sa IPA gisukod pinaagi sa liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), ang liver transcriptome analysis gihimo pinaagi sa total RNA sequencing, ug ang DNA methylation analysis gihimo gamit ang Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Ang human hepatic stellate cells (LX-2) gigamit alang sa in vitro nga mga eksperimento.
Ang lebel sa IPA sa serum adunay kalabutan sa ekspresyon sa mga gene nga nalambigit sa apoptotic, mitophagic, ug longevity pathways sa atay. Ang AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) gene mao ang labing daghan ug dominanteng interacting gene sa liver transcript ug DNA methylation profiles. Ang pagtambal sa IPA nag-induce sa apoptosis, mikunhod ang mitochondrial respiration, ug giusab ang cell morphology ug mitochondrial dynamics pinaagi sa pag-modulate sa ekspresyon sa mga gene nga nailhan nga nag-regulate sa fibrosis, apoptosis, ug survival sa mga LX-2 cells.
Kon tan-awon sa kinatibuk-an, kining mga datos nagsuporta nga ang IPA adunay potensyal nga mga epekto sa pagtambal ug mahimong hinungdan sa apoptosis ug mabalhin ang phenotype sa HSC ngadto sa usa ka dili aktibo nga estado, sa ingon nagpalapad sa posibilidad sa pagpugong sa fibrosis sa atay pinaagi sa pagpanghilabot sa pagpaaktibo sa HSC ug metabolismo sa mitochondrial.
Ang pagkaylap sa hilabihang katambok ug metabolic syndrome nalambigit sa nagkadaghang insidente sa metabolically associated fatty liver disease (MASLD); ang sakit makaapekto sa 25% ngadto sa 30% sa kinatibuk-ang populasyon [1]. Ang pangunang sangputanan sa MASLD etiology mao ang liver fibrosis, usa ka dinamikong proseso nga gihulagway sa padayon nga pagtapok sa fibrous extracellular matrix (ECM) [2]. Ang pangunang mga selula nga nalambigit sa liver fibrosis mao ang hepatic stellate cells (HSCs), nga nagpakita sa upat ka nailhan nga phenotypes: quiescent, activated, inactivated, ug senescent [3, 4]. Ang mga HSC mahimong ma-activate ug ma-transdifferentiate gikan sa usa ka quiescent form ngadto sa proliferative fibroblast-like cells nga adunay taas nga panginahanglan sa enerhiya, nga adunay dugang nga ekspresyon sa α-smooth muscle actin (α-SMA) ug type I collagen (Col-I) [5, 6]. Atol sa liver fibrosis reversal, ang activated HSCs mawagtang pinaagi sa apoptosis o inactivation. Kini nga mga proseso naglakip sa downregulation sa fibrogenic genes ug modulation sa prosurvival genes (sama sa NF-κB ug PI3K/Akt signaling pathways) [7, 8], ingon man mga pagbag-o sa mitochondrial dynamics ug function [9].
Ang lebel sa serum sa tryptophan metabolite nga indole-3-propionic acid (IPA), nga gihimo sa tinai, nakit-an nga mikunhod sa mga sakit sa metabolismo sa tawo lakip ang MASLD [10–13]. Ang IPA nalangkit sa pag-inom sa dietary fiber, nailhan tungod sa antioxidant ug anti-inflammatory nga mga epekto niini, ug nagpamenos sa diet-induced non-alcoholic steatohepatitis (NASH) phenotype in vivo ug in vitro [11–14]. Ang pipila ka ebidensya gikan sa among miaging pagtuon, nga nagpakita nga ang lebel sa serum IPA mas ubos sa mga pasyente nga adunay liver fibrosis kaysa sa mga pasyente nga tambok nga wala’y liver fibrosis sa Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Dugang pa, among gipakita nga ang pagtambal sa IPA mahimong makapakunhod sa ekspresyon sa mga gene nga klasikal nga mga marka sa cell adhesion, cell migration ug hematopoietic stem cell activation sa usa ka human hepatic stellate cell (LX-2) model ug usa ka potensyal nga hepatoprotective metabolite [15]. Bisan pa, nagpabilin nga dili klaro kung giunsa sa IPA ang pag-aghat sa liver fibrosis regression pinaagi sa pagpaaktibo sa HSC apoptosis ug mitochondrial bioenergetics.
Dinhi, among gipakita nga ang serum IPA nalangkit sa ekspresyon sa mga gene nga gipayaman sa apoptosis, mitophagy, ug longevity pathways sa atay sa mga obese apan dili type 2 diabetes (KOBS) nga mga indibidwal. Dugang pa, among nakita nga ang IPA mahimong makaaghat sa clearance ug degradation sa activated hematopoietic stem cells (HSCs) pinaagi sa inactivation pathway. Kini nga mga resulta nagpadayag sa usa ka bag-ong papel alang sa IPA, nga naghimo niini nga usa ka potensyal nga therapeutic target aron mapalambo ang liver fibrosis regression.
Usa ka miaging pagtuon sa KOBS cohort nagpakita nga ang mga pasyente nga adunay liver fibrosis adunay mas ubos nga circulating IPA levels kon itandi sa mga pasyente nga walay liver fibrosis [15]. Aron dili maapil ang posibleng confounding effect sa type 2 diabetes, among girekrut ang 116 ka mga pasyente nga tambok nga walay type 2 diabetes (average age ± SD: 46.8 ± 9.3 ka tuig; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Table 1) gikan sa nagpadayon nga KOBS study isip populasyon sa pagtuon [16]. Ang tanang partisipante mihatag og sinulat nga informed consent ug ang study protocol giaprobahan sa Ethics Committee sa North Savo County Hospital subay sa Declaration of Helsinki (54/2005, 104/2008 ug 27/2010).
Ang mga specimen sa biopsy sa atay gikuha atol sa bariatric surgery ug gisusi sa histological nga paagi sa mga eksperyensiyadong pathologist sumala sa naunang gihulagway nga mga criteria [17, 18]. Ang mga criteria sa pagtimbang-timbang gisumada sa Supplementary Table S1 ug gihulagway na kaniadto [19].
Ang mga sample sa fasting serum gisusi pinaagi sa untargeted liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) para sa metabolomics analysis (n = 116). Ang mga sample gisusi gamit ang UHPLC-qTOF-MS system (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) sama sa gihulagway kaniadto19. Ang pag-ila sa isopropyl alcohol (IPA) gibase sa retention time ug pagtandi sa MS/MS spectrum sa puro nga mga standard. Ang IPA signal intensity (peak area) gikonsiderar sa tanang dugang nga mga pag-analisar [20].
Ang whole liver RNA sequencing gihimo gamit ang Illumina HiSeq 2500 ug ang datos giproseso na daan sama sa gihulagway kaniadto [19, 21, 22]. Naghimo kami og targeted differential expression analysis sa mga transcript nga nakaapekto sa mitochondrial function/biogenesis gamit ang 1957 ka genes nga gipili gikan sa MitoMiner 4.0 database [23]. Ang liver DNA methylation analysis gihimo gamit ang Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) gamit ang parehas nga pamaagi nga gihulagway kaniadto [24, 25].
Ang mga human hepatic stellate cells (LX-2) gihatag ni Prof. Stefano Romeo ug gi-culture ug gimentinar sa DMEM/F12 medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Aron mapili ang working dose sa IPA, ang mga LX-2 cells gitambalan gamit ang lain-laing konsentrasyon sa IPA (10 μM, 100 μM ug 1 mM; Sigma, 220027) sa DMEM/F12 medium sulod sa 24 oras. Dugang pa, aron imbestigahan ang abilidad sa IPA sa pag-inactivate sa mga HSC, ang mga LX-2 cells gitambalan uban sa 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) ug 1 mM IPA sa serum-free medium sulod sa 24 oras. Para sa katugbang nga mga kontrol sa sakyanan, 4 nM HCL nga adunay 0.1% BSA ang gigamit para sa pagtambal sa TGF-β1 ug 0.05% DMSO ang gigamit para sa pagtambal sa IPA, ug pareho kining gigamit nga magkauban para sa kombinasyon nga pagtambal.
Ang apoptosis gisusi gamit ang FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit nga adunay 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) sumala sa mga instruksyon sa tiggama. Sa laktod nga pagkasulti, ang LX-2 (1 × 105 ka selula/well) gikultura sa tibuok gabii sa 12-well plates ug dayon gitambalan og daghang dosis sa IPA o IPA ug TGF-β1. Pagkasunod adlaw, ang naglutaw ug nagdikit nga mga selula gikolekta, gi-trypsinize, gihugasan gamit ang PBS, gi-resuspend sa Annexin V binding buffer, ug gi-incubate gamit ang FITC-Annexin V ug 7-AAD sulod sa 15 minutos.
Ang mitochondria sa buhing mga selula gipintalan para sa oxidative activity gamit ang Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Para sa MTR assays, ang mga LX-2 cells gi-incubate sa parehas nga densidad uban sa IPA ug TGF-β1. Human sa 24 ka oras, ang mga buhing selula gi-trypsinize, gihugasan gamit ang PBS, ug dayon gi-incubate gamit ang 100 μM MTR sa serum-free medium sa 37 °C sulod sa 20 minutos sama sa gihulagway kaniadto [26]. Para sa live cell morphology analysis, ang gidak-on sa selula ug cytoplasmic complexity gi-analisa gamit ang forward scatter (FSC) ug side scatter (SSC) parameters, matag usa.
Ang tanang datos (30,000 ka mga panghitabo) nakuha gamit ang NovoCyte Quanteon (Agilent) ug gisusi gamit ang NovoExpress® 1.4.1 o FlowJo V.10 software.
Ang oxygen consumption rate (OCR) ug extracellular acidification rate (ECAR) gisukod sa tinuod nga oras gamit ang Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) nga adunay Seahorse XF Cell Mito Stress sumala sa mga instruksyon sa tiggama. Sa laktod nga pagkasulti, 2 × 104 LX-2 cells/well ang gipugas sa XF96 cell culture plates. Human sa overnight incubation, ang mga cell gitambalan og isopropanol (IPA) ug TGF-β1 (Supplementary Methods 1). Ang data analysis gihimo gamit ang Seahorse XF Wave software, nga naglakip sa Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Gikan niini, usa ka Bioenergetic Health Index (BHI) ang gikalkulo [27].
Ang kinatibuk-ang RNA gi-transcribe ngadto sa cDNA. Alang sa piho nga mga pamaagi, tan-awa ang reperensya [15]. Ang lebel sa Human 60S ribosomal acidic protein P0 (RPLP0) ug cyclophilin A1 (PPIA) mRNA gigamit isip constitutive gene controls. Ang QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) gigamit uban sa TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) o sa Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), ug ang relative gene expression fold gikalkulo gamit ang comparative Ct value cycling parameters (ΔΔCt) ug ang ∆∆Ct nga pamaagi. Ang mga detalye sa mga primer gihatag sa Supplementary Tables S2 ug S3.
Ang Nuclear DNA (ncDNA) ug mitochondrial DNA (mtDNA) gikuha gamit ang DNeasy blood and tissue kit (Qiagen) sama sa gihulagway kaniadto [28]. Ang relatibong gidaghanon sa mtDNA gikalkulo pinaagi sa pagkalkulo sa ratio sa matag target nga rehiyon sa mtDNA ngadto sa geometric mean sa tulo ka rehiyon sa nuclear DNA (mtDNA/ncDNA), sama sa gidetalye sa Supplementary Methods 2. Ang mga detalye sa mga primer para sa mtDNA ug ncDNA gihatag sa Supplementary Table S4.
Ang mga buhing selula gi-stain gamit ang Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) aron makita ang intercellular ug intracellular mitochondrial networks. Ang mga LX-2 cells (1 × 104 cells/well) gi-culture sa mga glass slide sa katugbang nga glass-bottomed culture plates (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany). Pagkahuman sa 24 oras, ang mga buhing selula sa LX-2 gi-incubate gamit ang 100 μM MTR sulod sa 20 minuto sa 37 °C ug ang mga cell nuclei gi-stain gamit ang DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) sama sa gihulagway kaniadto [29]. Ang mga mitochondrial network gi-visualize gamit ang Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) nga adunay Zeiss LSM 800 confocal module sa 37 °C sa usa ka humidified atmosphere nga adunay 5% CO2 gamit ang 63×NA 1.3 objective. Nakakuha kami og napulo ka Z-series nga mga imahe alang sa matag tipo sa sample. Ang matag Z-series adunay 30 ka seksyon, ang matag usa adunay gibag-on nga 9.86 μm. Alang sa matag sample, ang mga imahe sa napulo ka lainlaing mga natad sa panan-aw nakuha gamit ang ZEN 2009 software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany), ug ang mitochondrial morphology analysis gihimo gamit ang ImageJ software (v1.54d) [30, 31] sumala sa mga parameter nga detalyado sa Supplementary Methods 3.
Ang mga selula gi-fix gamit ang 2% glutaraldehyde sa 0.1 M phosphate buffer, gisundan sa fixation gamit ang 1% osmium tetroxide solution (Sigma Aldrich, MO, USA), hinayhinay nga gi-dehydrate gamit ang acetone (Merck, Darmstadt, Germany), ug sa katapusan gi-embed sa epoxy resin. Ang mga ultrathin nga seksyon giandam ug gi-stain gamit ang 1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, Germany) ug 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, Germany). Ang mga ultrastructural nga imahe nakuha gamit ang JEM 2100F EXII transmission electron microscope (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) sa usa ka accelerating voltage nga 80 kV.
Ang morpolohiya sa mga selula sa LX-2 nga gitambalan og IPA sulod sa 24 oras gisusi pinaagi sa phase-contrast microscopy sa 50x magnification gamit ang Zeiss inverted light microscope (Zeiss Axio Vert.A1 ug AxioCam MRm, Jena, Germany).
Ang klinikal nga datos gipahayag isip mean ± standard deviation o median (interquartile range: IQR). Ang one-way analysis of variance (continuous variables) o χ² test (categorical variables) gigamit aron itandi ang mga kalainan tali sa tulo ka grupo sa pagtuon. Ang false positive rate (FDR) gigamit aron matul-id ang multiple testing, ug ang mga gene nga adunay FDR < 0.05 giisip nga statistically significant. Ang Spearman correlation analysis gigamit aron i-correlate ang CpG DNA methylation sa IPA signal intensity, nga adunay nominal p values ​​​​(p < 0.05) nga gitaho.
Ang pag-analisa sa agianan gihimo gamit ang usa ka web-based gene set analysis tool (WebGestalt) para sa 268 ka transcript (nominal p < 0.01), 119 ka mitochondria-associated transcripts (nominal p < 0.05), ug 4350 ka CpGs gikan sa 3093 ka liver transcripts nga nalambigit sa circulating serum IPA levels. Ang libre nga magamit nga Venny DB (bersyon 2.1.0) nga himan gigamit aron makit-an ang nagsapaw-sapaw nga mga gene, ug ang StringDB (bersyon 11.5) gigamit aron makita ang mga interaksyon sa protina-protina.
Para sa eksperimento sa LX-2, ang mga sample gisulayan para sa normalidad gamit ang D'Agostino-Pearson test. Ang datos nakuha gikan sa labing menos tulo ka biological replicates ug gipailalom sa one-way ANOVA gamit ang Bonferroni post hoc test. Ang p-value nga ubos sa 0.05 giisip nga statistically significant. Ang datos gipresentar isip mean ± SD, ug ang gidaghanon sa mga eksperimento gipakita sa matag hulagway. Ang tanang pag-analisa ug mga graph gihimo gamit ang GraphPad Prism 8 statistical software para sa Windows (GraphPad Software Inc., bersyon 8.4.3, San Diego, USA).
Una, among gisusi ang asosasyon sa lebel sa serum IPA sa mga transcript sa atay, tibuok lawas, ug mitochondrial. Sa kinatibuk-ang profile sa transcript, ang pinakakusog nga gene nga nalangkit sa lebel sa serum IPA mao ang MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); sa profile sa transcript nga may kalabutan sa mitochondria, ang pinakakusog nga gene nga nalangkit mao ang AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Dugang nga file 1 ug Dugang nga file 2).
Among gisusi dayon ang mga global transcript (n = 268; p < 0.01) ug mga mitochondria-associated transcript (n = 119; p < 0.05), nga sa katapusan nakaila sa apoptosis isip ang labing hinungdanon nga canonical pathway (p = 0.0089). Para sa mga mitochondrial transcript nga nalangkit sa serum IPA levels, among gipunting ang apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagy (FDR = 0.00029), ug TNF signaling pathways (FDR = 0.000006) (Figure 1A, Table 2, ug Supplementary Figures 1A-B).
Nagsapaw-sapaw nga pag-analisa sa global, mitochondria-associated transcripts, ug DNA methylation sa atay sa tawo nga may kalabutan sa lebel sa serum IPA. Ang A nagrepresentar sa 268 ka global transcripts, 119 ka mitochondria-associated transcripts, ug DNA methylated transcripts nga gimapa sa 3092 ka CpG sites nga may kalabutan sa lebel sa serum IPA (p values ​​​​< 0.01 para sa global transcripts ug DNA methylated, ug p values ​​​​< 0.05 para sa mitochondrial transcripts). Ang mga mayor nga nagsapaw-sapaw nga transcripts gipakita sa tunga (AKT1 ug YKT6). B Ang interaction map sa 13 ka genes nga adunay pinakataas nga interaction score (0.900) sa ubang mga genes gitukod gikan sa 56 ka nagsapaw-sapaw nga genes (black line region) nga adunay dakong kalabutan sa lebel sa serum IPA gamit ang online tool nga StringDB. Berde: Ang mga genes gimapa sa Gene Ontology (GO) cellular component: mitochondria (GO:0005739). Ang AKT1 mao ang protina nga adunay pinakataas nga score (0.900) para sa interaksyon sa ubang mga protina base sa datos (base sa text mining, mga eksperimento, mga database, ug co-expression). Ang mga network node nagrepresentar sa mga protina, ug ang mga ngilit nagrepresentar sa mga koneksyon tali sa mga protina.
Tungod kay ang mga metabolite sa gut microbiota maka-regulate sa epigenetic composition pinaagi sa DNA methylation [32], among gisusi kung ang serum IPA levels nalambigit ba sa liver DNA methylation. Among nakita nga ang duha ka mayor nga methylation sites nga nalambigit sa serum IPA levels duol sa proline-serine-rich region 3 (C19orf55) ug heat shock protein family B (small) member 6 (HSPB6) (Dugang nga file 3). Ang DNA methylation sa 4350 CpG (p < 0.01) nalambigit sa serum IPA levels ug gipayaman sa longevity regulatory pathways (p = 0.006) (Figure 1A, Table 2, ug Supplementary Figure 1C).
Aron masabtan ang mga mekanismo sa biyolohikal nga nagpahipi sa mga asosasyon tali sa lebel sa serum IPA, global transcripts, mitochondria-associated transcripts, ug DNA methylation sa atay sa tawo, naghimo kami og overlap analysis sa mga gene nga giila sa miaging pathway analysis (Figure 1A). Ang mga resulta sa pathway enrichment analysis sa 56 ka nagsapaw-sapaw nga mga gene (sulod sa itom nga linya sa Figure 1A) nagpakita nga ang apoptosis pathway (p = 0.00029) nagpasiugda sa duha ka gene nga komon sa tulo ka pag-analisa: AKT1 ug YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), sama sa gipakita sa Venn diagram (Supplementary Figure 2 ug Figure 1A). Makapainteres, among nakita nga ang AKT1 (cg19831386) ug YKT6 (cg24161647) positibo nga nakig-uban sa lebel sa serum IPA (Dugang nga file 3). Aron mailhan ang potensyal nga mga interaksyon sa protina tali sa mga produkto sa gene, mipili kami og 13 ka gene nga adunay pinakataas nga common region score (0.900) taliwala sa 56 ka nagsapaw-sapaw nga mga gene isip input ug naghimo og interaction map. Subay sa lebel sa pagsalig (marginal confidence), ang AKT1 gene nga adunay pinakataas nga iskor (0.900) naa sa ibabaw (Figure 1B).
Base sa pathway analysis, among nakita nga ang apoptosis mao ang mayor nga pathway, busa among gisusi kung ang IPA treatment makaapekto ba sa apoptosis sa HSCs in vitro. Gipakita namo kaniadto nga ang lain-laing dosis sa IPA (10 μM, 100 μM, ug 1 mM) dili makahilo sa mga LX-2 cells [15]. Kini nga pagtuon nagpakita nga ang IPA treatment sa 10 μM ug 100 μM nagdugang sa gidaghanon sa mabuhi ug necrotic cells. Bisan pa, kon itandi sa control group, ang cell viability mikunhod sa 1 mM IPA concentration, samtang ang cell necrosis rate nagpabilin nga wala mausab (Figure 2A, B). Sunod, aron makit-an ang labing maayo nga konsentrasyon aron ma-induce ang apoptosis sa mga LX-2 cells, among gisulayan ang 10 μM, 100 μM, ug 1 mM IPA sulod sa 24 oras (Figure 2A-E ug Supplementary Figure 3A-B). Makapainteres nga ang IPA 10 μM ug 100 μM mikunhod sa apoptosis rate (%), apan, ang IPA 1 mM mipataas sa late apoptosis ug apoptosis rate (%) kon itandi sa control ug busa gipili alang sa dugang nga mga eksperimento (Figures 2A–D).
Ang IPA nag-induce sa apoptosis sa mga LX-2 cells. Gigamit ang Annexin V ug 7-AAD double staining method aron masukod ang apoptotic rate ug cell morphology pinaagi sa flow cytometry. Ang mga BA cells gi-incubate gamit ang 10 μM, 100 μM ug 1 mM IPA sulod sa 24 oras o gamit ang F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ug 1 mM IPA sa serum-free medium sulod sa 24 oras. A: living cells (Annexin V -/ 7AAD-); B: necrotic cells (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: early (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: late (Annexin V+/7AAD.+); E, H: percentage sa total early ug late apoptotic cells sa apoptotic rate (%). Ang data gipahayag isip mean ± SD, n = 3 independent experiments. Ang statistical comparisons gihimo gamit ang one-way ANOVA uban sa Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Sama sa among gipakita kaniadto, ang 5 ng/ml TGF-β1 mahimong maka-induce sa HSC activation pinaagi sa pagdugang sa expression sa classical marker genes [15]. Ang LX-2 cells gitambalan og 5 ng/ml TGF-β1 ug 1 mM IPA nga gihiusa (Fig. 2E–H). Ang TGF-β1 treatment wala makausab sa apoptosis rate, apan, ang IPA co-treatment nagdugang sa late apoptosis ug apoptosis rate (%) kon itandi sa TGF-β1 treatment (Fig. 2E–H). Kini nga mga resulta nagpakita nga ang 1 mM IPA maka-promote sa apoptosis sa LX-2 cells nga independente sa TGF-β1 induction.
Dugang namong gisusi ang epekto sa IPA sa mitochondrial respiration sa LX-2 cells. Ang mga resulta nagpakita nga ang 1 mM IPA mikunhod sa oxygen consumption rate (OCR) parameters: non-mitochondrial respiration, basal ug maximal respiration, proton leak ug ATP production kon itandi sa control group (Figure 3A, B), samtang ang bioenergetic health index (BHI) wala mausab.
Ang IPA nagpamenos sa mitochondrial respiration sa mga LX-2 cells. Ang mitochondrial respiration curve (OCR) gipresentar isip mitochondrial respiration parameters (non-mitochondrial respiration, basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP generation, SRC ug BHI). Ang mga cell A ug B gi-incubate gamit ang 10 μM, 100 μM ug 1 mM IPA sulod sa 24 oras, matag usa. Ang mga cell C ug D gi-incubate gamit ang TGF-β1 (5 ng/ml) ug 1 mM IPA sa serum-free medium sulod sa 24 oras, matag usa. Ang tanang sukod gi-normalize sa DNA content gamit ang CyQuant kit. BHI: bioenergetic health index; SRC: respiratory reserve capacity; OCR: oxygen consumption rate. Ang datos gipresentar isip mean ± standard deviation (SD), n = 5 independent experiments. Ang mga statistical comparison gihimo gamit ang one-way ANOVA ug Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ug ***p < 0.001
Aron makakuha og mas komprehensibo nga pagsabot sa epekto sa IPA sa bioenergetic profile sa TGF-β1-activated LX-2 cells, among gisusi ang mitochondrial oxidative phosphorylation pinaagi sa OCR (Fig. 3C,D). Ang mga resulta nagpakita nga ang pagtambal sa TGF-β1 makapakunhod sa maximum respiration, respiratory reserve capacity (SRC) ug BHI kon itandi sa control group (Fig. 3C,D). Dugang pa, ang kombinasyon nga pagtambal nakapakunhod sa basal respiration, proton leak ug ATP production, apan ang SRC ug BHI mas taas kay sa mga gitambalan og TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Gihimo usab namo ang "Cellular Energy Phenotype Test" nga gihatag sa Seahorse software (Supplementary Fig. 4A–D). Sama sa gipakita sa Supplementary Fig. 3B, ang parehong OCR ug ECAR metabolic potentials mikunhod human sa TGF-β1 treatment, bisan pa, walay nakitang kalainan sa combination ug IPA treatment groups kon itandi sa control group. Dugang pa, ang parehong basal ug stress levels sa OCR mikunhod human sa combination ug IPA treatment kon itandi sa control group (Supplementary Fig. 4C). Makapainteres, usa ka susamang pattern ang naobserbahan sa combination therapy, diin walay nakitang pagbag-o sa basal ug stress levels sa ECAR kon itandi sa TGF-β1 treatment (Supplementary Fig. 4C). Sa mga HSC, ang pagkunhod sa mitochondrial oxidative phosphorylation ug ang abilidad sa combination treatment sa pagpahiuli sa SCR ug BHI human sa exposure sa TGF-β1 treatment wala makausab sa metabolic potential (OCR ug ECAR). Kon tan-awon sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagpakita nga ang IPA mahimong makapakunhod sa bioenergetics sa mga HSC, nga nagsugyot nga ang IPA mahimong mag-induce og mas ubos nga energy profile nga magbalhin sa HSC phenotype padulong sa inactivation (Supplementary Figure 4D).
Ang epekto sa IPA sa mitochondrial dynamics gisusi gamit ang three-dimensional quantification sa mitochondrial morphology ug network connections ingon man ang MTR staining (Figure 4 ug Supplementary Figure 5). Gipakita sa Figure 4 nga, kon itandi sa control group, ang TGF-β1 treatment mikunhod sa mean surface area, branch number, total branch length, ug branch junction number (Figure 4A ug B) ug giusab ang proporsyon sa mitochondria gikan sa spherical ngadto sa intermediate morphology (Figure 4C). Ang IPA treatment lang ang mikunhod sa mean mitochondrial volume ug giusab ang proporsyon sa mitochondria gikan sa spherical ngadto sa intermediate morphology kon itandi sa control group (Figure 4A). Sa kasukwahi, ang sphericity, mean branch length, ug mitochondrial activity nga gisusi sa mitochondrial membrane potential-dependent MTR (Figure 4A ug E) nagpabilin nga wala mausab ug kini nga mga parameter wala magkalahi tali sa mga grupo. Kung tan-awon sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang TGF-β1 ug IPA treatment daw nag-modulate sa porma ug gidak-on sa mitochondrial ingon man sa network complexity sa buhing LX-2 cells.
Ang IPA nag-usab sa mitochondrial dynamics ug mitochondrial DNA abundance sa LX-2 cells. A. Representative confocal images sa live LX-2 cells nga gi-incubate sa TGF-β1 (5 ng/ml) ug 1 mM IPA sulod sa 24 oras sa serum-free medium nga nagpakita sa mitochondrial networks nga gi-stain gamit ang Mitotracker™ Red CMXRos ug nuclei nga gi-stain og blue gamit ang DAPI. Ang tanang datos adunay labing menos 15 ka mga imahe matag grupo. Nakakuha kami og 10 ka Z-stack images para sa matag sample type. Ang matag Z-axis sequence adunay 30 ka slices, matag usa adunay gibag-on nga 9.86 μm. Scale bar: 10 μm. B. Representative objects (mitochondria lamang) nga giila pinaagi sa pag-apply og adaptive thresholding sa imahe. Ang quantitative analysis ug pagtandi sa mitochondrial morphological network connections gihimo para sa tanang cells sa matag grupo. C. Frequency sa mitochondrial shape ratios. Ang mga kantidad nga duol sa 0 nagpakita og spherical shapes, ug ang mga kantidad nga duol sa 1 nagpakita og filamentous shapes. D Ang sulod sa Mitochondrial DNA (mtDNA) gitino sama sa gihulagway sa Materials and Methods. Ang E Mitotracker™ Red CMXRos analysis gihimo pinaagi sa flow cytometry (30,000 ka mga panghitabo) sama sa gihulagway sa Materials and Methods. Ang datos gipresentar isip mean ± SD, n = 3 ka independenteng mga eksperimento. Ang mga pagtandi sa estadistika gihimo gamit ang one-way ANOVA ug Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Among gisusi dayon ang mtDNA content sa LX-2 cells isip timailhan sa mitochondrial number. Kon itandi sa control group, ang mtDNA content misaka sa TGF-β1-treated group (Figure 4D). Kon itandi sa TGF-β1-treated group, ang mtDNA content mikunhod sa combination treatment group (Figure 4D), nga nagsugyot nga ang IPA mahimong makapakunhod sa mtDNA content ug posible sa mitochondrial number ingon man sa mitochondrial respiration (Figure 3C). Dugang pa, ang IPA daw nakapakunhod sa mtDNA content sa combination treatment apan wala makaapekto sa MTR-mediated mitochondrial activity (Figures 4A–C).
Among gisusi ang kalambigitan sa IPA sa lebel sa mRNA sa mga gene nga nalangkit sa fibrosis, apoptosis, survival, ug mitochondrial dynamics sa mga LX-2 cells (Figure 5A–D). Kon itandi sa control group, ang TGF-β1-treated group nagpakita og dugang nga ekspresyon sa mga gene sama sa collagen type I α2 chain (COL1A2), α-smooth muscle actin (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), tissue inhibitor sa metalloproteinase 1 (TIMP1), ug dynamin 1-like gene (DRP1), nga nagpakita og dugang nga fibrosis ug activation. Dugang pa, kon itandi sa control group, ang pagtambal sa TGF-β1 nakapakunhod sa lebel sa mRNA sa nuclear pregnane X receptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor sa B-cell α, enhancer sa nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), ug inhibitor sa nuclear factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Figure 5A–D). Kon itandi sa pagtambal sa TGF-β1, ang kombinasyon sa pagtambal gamit ang TGF-β1 ug IPA nakapakunhod sa ekspresyon sa COL1A2 ug MMP2, apan nakapataas sa lebel sa mRNA sa PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, ug IKBKB. Ang pagtambal sa IPA nakapakunhod pag-ayo sa ekspresyon sa MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1), ug mitochondrial fusion protein 2 (MFN2), samtang ang ekspresyon sa CASP8, NFκB1A, NFκB1B, ug IKBKB misaka kon itandi sa control group. Apan, walay nakitang kalainan sa ekspresyon sa caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1), ug fission protein 1 (FIS1). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang pagtambal sa IPA nag-modulate sa ekspresyon sa mga gene nga nalangkit sa fibrosis, apoptosis, survival, ug mitochondrial dynamics. Ang among datos nagsugyot nga ang pagtambal sa IPA nagpamenos sa fibrosis sa mga selula sa LX-2; sa samang higayon, kini nagdasig sa survival pinaagi sa pagbalhin sa phenotype ngadto sa inactivation.
Ang IPA nag-modulate sa ekspresyon sa fibroblast, apoptotic, viability, ug mitochondrial dynamics genes sa LX-2 cells. Ang mga histogram nagpakita sa mRNA expression relatibo sa endogenous control (RPLP0 o PPIA) human ang LX-2 cells gi-induce gamit ang TGF-β1 ug IPA sa serum-free medium sulod sa 24 oras. Ang A nagpakita sa fibroblasts, ang B nagpakita sa apoptotic cells, ang C nagpakita sa survivor cells, ug ang D nagpakita sa mitochondrial dynamics gene expression. Ang datos gipresentar isip mean ± standard deviation (SD), n = 3 independent experiments. Ang mga statistical comparison gihimo gamit ang one-way ANOVA ug Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Dayon, ang mga pagbag-o sa gidak-on sa selula (FSC-H) ug cytoplasmic complexity (SSC-H) gisusi pinaagi sa flow cytometry (Figure 6A,B), ug ang mga pagbag-o sa morphology sa selula human sa pagtambal sa IPA gisusi pinaagi sa transmission electron microscopy (TEM) ug phase contrast microscopy (Supplementary Figure 6A-B). Sama sa gilauman, ang mga selula sa grupo nga gitambalan og TGF-β1 misaka sa gidak-on kon itandi sa control group (Figure 6A,B), nga nagpakita sa klasiko nga pagpalapad sa rough endoplasmic reticulum (ER*) ug phagolysosomes (P), nga nagpakita sa hematopoietic stem cell (HSC) activation (Supplementary Figure 6A). Bisan pa, kon itandi sa grupo nga gitambalan og TGF-β1, ang gidak-on sa selula, cytoplasmic complexity (Fig. 6A,B), ug ang sulod sa ER* mikunhod sa grupo nga gitambalan og kombinasyon sa TGF-β1 ug IPA (Supplementary Fig. 6A). Dugang pa, ang pagtambal sa IPA mikunhod sa gidak-on sa selula, cytoplasmic complexity (Figs. 6A,B), ang sulod sa P ug ER* (Supplementary Fig. 6A) kon itandi sa control group. Dugang pa, ang sulod sa apoptotic cells misaka human sa 24 oras nga pagtambal sa IPA kon itandi sa control group (puti nga mga pana, Supplementary Fig. 6B). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang 1 mM IPA makapadasig sa HSC apoptosis ug makabaliktad sa mga pagbag-o sa mga parameter sa morphology sa cell nga gipahinabo sa TGF-β1, sa ingon nag-regulate sa gidak-on ug pagkakomplikado sa cell, nga mahimong nalangkit sa pag-inactivate sa HSC.
Ang IPA nag-usab sa gidak-on sa selula ug cytoplasmic complexity sa mga selula sa LX-2. Mga representatibong hulagway sa flow cytometry analysis. Ang pag-analisa migamit og gating strategy nga espesipiko para sa mga selula sa LX-2: SSC-A/FSC-A aron ipasabot ang populasyon sa selula, FSC-H/FSC-A aron mailhan ang mga doublet, ug SSC-H/FSC-H para sa pag-analisa sa gidak-on ug complexity sa selula. Ang mga selula gi-incubate gamit ang TGF-β1 (5 ng/ml) ug 1 mM IPA sa serum-free medium sulod sa 24 oras. Ang mga selula sa LX-2 giapod-apod sa ubos nga wala nga quadrant (SSC-H-/FSC-H-), ibabaw nga wala nga quadrant (SSC-H+/FSC-H-), ubos nga tuo nga quadrant (SSC-H-/FSC-H+), ug ibabaw nga tuo nga quadrant (SSC-H+/FSC-H+) para sa pag-analisa sa gidak-on sa selula ug cytoplasmic complexity. B. Ang morphology sa selula gi-analisa pinaagi sa flow cytometry gamit ang FSC-H (forward scatter, gidak-on sa selula) ug SSC-H (side scatter, cytoplasmic complexity) (30,000 ka mga panghitabo). Ang datos gipresentar isip mean ± SD, n = 3 ka independenteng eksperimento. Ang mga pagtandi sa estadistika gihimo gamit ang one-way ANOVA ug Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ug ****p < 0.0001
Ang mga metabolite sa tinai sama sa IPA nahimong init nga hilisgutan sa panukiduki, nga nagsugyot nga ang mga bag-ong target mahimong madiskobrehan sa gut microbiota. Busa, makapainteres nga ang IPA, usa ka metabolite nga among nalambigit sa fibrosis sa atay sa mga tawo [15], gipakita nga usa ka potensyal nga anti-fibrotic compound sa mga modelo sa hayop [13, 14]. Dinhi, among gipakita sa unang higayon ang usa ka asosasyon tali sa serum IPA ug global liver transcriptomics ug DNA methylation sa mga tambok nga indibidwal nga walay type 2 diabetes (T2D), nga nagpasiugda sa apoptosis, mitophagy ug taas nga kinabuhi, ingon man usa ka posible nga kandidato nga gene nga AKT1 nga nag-regulate sa homeostasis sa atay. Laing bag-o sa among pagtuon mao nga among gipakita ang interaksyon sa pagtambal sa IPA sa apoptosis, morphology sa selula, mitochondrial bioenergetics ug dinamika sa mga selula sa LX-2, nga nagpakita sa usa ka mas ubos nga spectrum sa enerhiya nga nagbalhin sa HSC phenotype padulong sa inactivation, nga naghimo sa IPA nga usa ka potensyal nga kandidato alang sa pagpaayo sa fibrosis sa atay.
Among nakita nga ang apoptosis, mitophagy ug longevity mao ang labing importante nga canonical pathways nga gipayaman sa mga gene sa atay nga nalangkit sa circulating serum IPA. Ang pagkabalda sa mitochondrial quality control (MQC) system mahimong mosangpot sa mitochondrial dysfunction, mitophagy ug apoptosis, sa ingon nagpasiugda sa pagkahitabo sa MASLD[33, 34]. Busa, mahimo natong hunahunaon nga ang IPA mahimong nalambigit sa pagmintinar sa cell dynamics ug mitochondrial integrity pinaagi sa apoptosis, mitophagy ug longevity sa atay. Ang among datos nagpakita nga duha ka gene ang komon sa tulo ka assays: YKT6 ug AKT1. Angayan nga matikdan nga ang YKT6 usa ka SNARE protein nga nalambigit sa proseso sa cell membrane fusion. Kini adunay papel sa autophagy ug mitophagy pinaagi sa pagporma og initiation complex uban sa STX17 ug SNAP29 sa autophagosome, sa ingon nagpasiugda sa fusion sa mga autophagosome ug lysosome[35]. Dugang pa, ang pagkawala sa function sa YKT6 moresulta sa pagkadaot sa mitophagy[36], samtang ang upregulation sa YKT6 nalangkit sa pag-uswag sa hepatocellular carcinoma (HCC), nga nagpakita sa dugang nga cell survival[37]. Sa laing bahin, ang AKT1 mao ang labing importante nga interacting gene ug adunay importanteng papel sa mga sakit sa atay, lakip ang PI3K/AKT signaling pathway, cell cycle, cell migration, proliferation, focal adhesion, mitochondrial function, ug collagen secretion[38–40]. Ang gi-activate nga PI3K/AKT signaling pathway makapa-activate sa hematopoietic stem cells (HSCs), nga mao ang mga selula nga responsable sa paghimo sa extracellular matrix (ECM), ug ang dysregulation niini mahimong makatampo sa pagkahitabo ug pag-uswag sa liver fibrosis[40]. Dugang pa, ang AKT usa sa mga importanteng cell survival factors nga nagpugong sa p53-dependent cell apoptosis, ug ang AKT activation mahimong nalangkit sa pagpugong sa liver cell apoptosis[41, 42]. Ang nakuha nga mga resulta nagsugyot nga ang IPA mahimong nalambigit sa liver mitochondria-associated apoptosis pinaagi sa pag-apekto sa desisyon sa mga hepatocytes tali sa pagsulod sa apoptosis o survival. Kini nga mga epekto mahimong i-regulate sa AKT ug/o YKT6 candidate genes, nga kritikal alang sa homeostasis sa atay.
Ang among mga resulta nagpakita nga ang 1 mM IPA nag-induce sa apoptosis ug mikunhod ang mitochondrial respiration sa mga LX-2 cells nga wala’y labot sa pagtambal sa TGF-β1. Matikdan nga ang apoptosis usa ka mayor nga agianan alang sa pagsulbad sa fibrosis ug hematopoietic stem cell (HSC) activation, ug usa usab ka hinungdanon nga panghitabo sa mabaliktad nga physiological response sa liver fibrosis [4, 43]. Dugang pa, ang pagpahiuli sa BHI sa mga LX-2 cells pagkahuman sa kombinasyon nga pagtambal naghatag bag-ong mga panabut sa potensyal nga papel sa IPA sa regulasyon sa mitochondrial bioenergetics. Ubos sa mga kondisyon sa pagpahulay ug dili aktibo, ang mga hematopoietic cells kasagaran mogamit sa mitochondrial oxidative phosphorylation aron makahimo og ATP ug adunay ubos nga metabolic activity. Sa laing bahin, ang HSC activation nagpalambo sa mitochondrial respiration ug biosynthesis aron mabayran ang mga panginahanglanon sa enerhiya sa pagsulod sa glycolytic state [44]. Ang kamatuoran nga ang IPA wala makaapekto sa metabolic potential ug ECAR nagsugyot nga ang glycolytic pathway dili kaayo prayoridad. Sa susama, ang laing pagtuon nagpakita nga ang 1 mM IPA nakahimo sa pag-modulate sa mitochondrial respiratory chain activity sa mga cardiomyocytes, human hepatocyte cell line (Huh7) ug human umbilical vein endothelial cells (HUVEC); Apan, walay nakitang epekto sa IPA sa glycolysis sa mga cardiomyocytes, nga nagsugyot nga ang IPA mahimong makaapekto sa bioenergetics sa ubang mga tipo sa selula [45]. Busa, among gihunahuna nga ang 1 mM IPA mahimong molihok isip usa ka malumo nga kemikal nga uncoupler, tungod kay kini makapakunhod pag-ayo sa fibrogenic gene expression, cell morphology ug mitochondrial bioenergetics nga dili mausab ang gidaghanon sa mtDNA [46]. Ang mga mitochondrial uncoupler makapugong sa culture-induced fibrosis ug HSC activation [47] ug makapakunhod sa mitochondrial ATP production nga gi-regulate o gi-induce sa pipila ka mga protina sama sa uncoupling proteins (UCP) o adenine nucleotide translocase (ANT). Depende sa tipo sa selula, kini nga panghitabo makaprotekta sa mga selula gikan sa apoptosis ug/o makapalambo sa apoptosis [46]. Bisan pa, gikinahanglan ang dugang nga mga pagtuon aron maklaro ang papel sa IPA isip usa ka mitochondrial uncoupler sa hematopoietic stem cell inactivation.
Among gisusi dayon kon ang mga pagbag-o sa mitochondrial respiration makita ba sa mitochondrial morphology sa buhing LX-2 cells. Makapainteres, ang pagtambal sa TGF-β1 nag-usab sa mitochondrial proportion gikan sa spherical ngadto sa intermediate, nga adunay pagkunhod sa mitochondrial branching ug pagtaas sa expression sa DRP1, usa ka importanteng factor sa mitochondrial fission [48]. Dugang pa, ang mitochondrial fragmentation nalangkit sa kinatibuk-ang network complexity, ug ang transisyon gikan sa fusion ngadto sa fission importante para sa hematopoietic stem cell (HSC) activation, samtang ang pagpugong sa mitochondrial fission mosangpot sa HSC apoptosis [49]. Busa, ang among mga resulta nagpakita nga ang pagtambal sa TGF-β1 mahimong mag-induce sa pagkunhod sa mitochondrial network complexity nga adunay pagkunhod sa branching, nga mas komon sa mitochondrial fission nga nalangkit sa activated hematopoietic stem cells (HSCs). Dugang pa, ang among datos nagpakita nga ang IPA makausab sa proporsyon sa mitochondria gikan sa spherical ngadto sa intermediate nga porma, sa ingon makunhuran ang expression sa OPA1 ug MFN2. Gipakita sa mga pagtuon nga ang downregulation sa OPA1 mahimong hinungdan sa pagkunhod sa mitochondrial membrane potential ug maka-trigger sa cell apoptosis[50]. Ang MFN2 nailhan nga mo-mediate sa mitochondrial fusion ug apoptosis[51]. Ang nakuha nga mga resulta nagsugyot nga ang induction sa LX-2 cells pinaagi sa TGF-β1 ug/o IPA daw nag-modulate sa porma ug gidak-on sa mitochondrial, ingon man sa activation state ug network complexity.
Ang among mga resulta nagpakita nga ang kombinasyon sa pagtambal sa TGFβ-1 ug IPA makapakunhod sa mtDNA ug mga parameter sa morphology sa selula pinaagi sa pag-regulate sa mRNA expression sa fibrosis, apoptosis ug mga gene nga may kalabutan sa survival sa mga selula nga naglikay sa apoptosis. Sa tinuud, ang IPA nakapakunhod sa lebel sa ekspresyon sa mRNA sa AKT1 ug mga importanteng gene sa fibrosis sama sa COL1A2 ug MMP2, apan nakapataas sa lebel sa ekspresyon sa CASP8, nga nalangkit sa apoptosis. Ang among mga resulta nagpakita nga pagkahuman sa pagtambal sa IPA, ang ekspresyon sa BAX mikunhod ug ang ekspresyon sa mRNA sa mga subunit sa pamilya sa TIMP1, BCL-2 ug NF-κB misaka, nga nagsugyot nga ang IPA makapukaw sa mga signal sa survival sa mga hematopoietic stem cell (HSC) nga naglikay sa apoptosis. Kini nga mga molekula mahimong molihok isip mga signal sa pro-survival sa mga gi-activate nga hematopoietic stem cell, nga mahimong nalangkit sa dugang nga ekspresyon sa mga anti-apoptotic nga protina (sama sa Bcl-2), pagkunhod sa ekspresyon sa pro-apoptotic BAX, ug usa ka komplikado nga interaksyon tali sa TIMP ug NF-κB [5, 7]. Ang IPA nagpakita sa iyang mga epekto pinaagi sa PXR, ug among nakita nga ang kombinasyon sa pagtambal gamit ang TGF-β1 ug IPA nagdugang sa lebel sa ekspresyon sa PXR mRNA, nga nagpakita sa pagpugong sa pagpaaktibo sa HSC. Ang gipaaktibo nga PXR signaling nahibal-an nga nagpugong sa pagpaaktibo sa HSC sa vivo ug in vitro [52, 53]. Ang among mga resulta nagpakita nga ang IPA mahimong moapil sa pagtangtang sa gipaaktibo nga HSC pinaagi sa pagpasiugda sa apoptosis, pagkunhod sa fibrosis ug mitochondrial metabolism, ug pagpausbaw sa mga signal sa survival, nga tipikal nga mga proseso nga nag-convert sa gipaaktibo nga HSC phenotype ngadto sa usa ka dili aktibo. Laing posible nga pagpasabut alang sa potensyal nga mekanismo ug papel sa IPA sa apoptosis mao nga kini nag-scavenge sa dysfunctional mitochondria labi na pinaagi sa mitophagy (intrinsic pathway) ug ang extrinsic TNF signaling pathway (Table 1), nga direktang nalambigit sa NF-κB survival signaling pathway (Supplementary Figure 7). Makapainteres, ang mga gene nga may kalabutan sa IPA makahimo sa pag-induce sa mga pro-apoptotic ug pro-survival signal sa apoptotic pathway [54], nga nagsugyot nga ang IPA mahimong mag-induce sa apoptotic pathway o survival pinaagi sa pagpakig-uban niining mga gene. Apan, kon giunsa sa IPA pag-aghat sa apoptosis o survival atol sa HSC activation ug ang mga mekanistikong agianan niini nagpabiling dili klaro.
Ang IPA usa ka microbial metabolite nga naporma gikan sa dietary tryptophan pinaagi sa gut microbiota. Gipakita sa mga pagtuon nga kini adunay anti-inflammatory, antioxidant, ug epigenetic regulatory properties sa intestinal environment.[55] Gipakita sa mga pagtuon nga ang IPA maka-modulate sa intestinal barrier function ug makapakunhod sa oxidative stress, nga mahimong makatampo sa lokal nga physiological effects niini.[56] Sa tinuud, ang IPA gidala ngadto sa mga target nga organo pinaagi sa sirkulasyon, ug tungod kay ang IPA adunay parehas nga major metabolite structure sa tryptophan, serotonin, ug indole derivatives, ang IPA adunay metabolic actions nga moresulta sa competitive metabolic fates.[52] Ang IPA mahimong makigkompetensya sa mga metabolite nga gikan sa tryptophan alang sa mga binding site sa mga enzyme o receptor, nga posibleng makabalda sa normal nga metabolic pathways. Kini nagpasiugda sa panginahanglan alang sa dugang nga mga pagtuon sa pharmacokinetics ug pharmacodynamics niini aron mas masabtan ang therapeutic window niini.[57] Kinahanglan pa nga makita kung kini mahimo usab nga mahitabo sa hematopoietic stem cells (HSCs).
Giila namo nga ang among pagtuon adunay pipila ka mga limitasyon. Aron espesipikong susihon ang mga asosasyon nga may kalabotan sa IPA, wala namo gilakip ang mga pasyente nga adunay type 2 diabetes mellitus (T2DM). Giila namo nga kini naglimite sa lapad nga paggamit sa among mga nahibal-an sa mga pasyente nga adunay type 2 diabetes mellitus ug advanced liver disease. Bisan kung ang physiological concentration sa IPA sa human serum kay 1–10 μM [11, 20], ang konsentrasyon nga 1 mM IPA gipili base sa pinakataas nga non-toxic concentration [15] ug ang pinakataas nga rate sa apoptosis, nga walay kalainan sa porsyento sa necrotic cell population. Bisan kung ang supraphysiological levels sa IPA gigamit niini nga pagtuon, sa pagkakaron walay consensus bahin sa epektibo nga dosis sa IPA [52]. Bisan kung ang among mga resulta hinungdanon, ang mas lapad nga metabolic fate sa IPA nagpabilin nga usa ka aktibo nga lugar sa panukiduki. Dugang pa, ang among mga nahibal-an sa asosasyon tali sa serum IPA levels ug DNA methylation sa liver transcripts nakuha dili lamang gikan sa hematopoietic stem cells (HSCs) apan gikan usab sa mga tisyu sa atay. Among gipili nga gamiton ang mga selula sa LX-2 sa tawo base sa among nangaging mga nahibal-an gikan sa transcriptome analysis nga ang IPA nalangkit sa hematopoietic stem cell (HSC) activation [15], ug ang mga HSC mao ang mga nag-unang selula nga nalambigit sa pag-uswag sa liver fibrosis. Ang atay gilangkoban sa daghang mga tipo sa selula, busa ang ubang mga modelo sa selula sama sa hepatocyte-HSC-immune cell co-culture system nga giubanan sa caspase activation ug DNA fragmentation ingon man ang mekanismo sa aksyon lakip ang lebel sa protina kinahanglan nga ikonsiderar aron tun-an ang papel sa IPA ug ang interaksyon niini sa ubang mga tipo sa selula sa atay.