Ang artikulo kabahin sa hilisgutan sa panukiduki nga "Pagpauswag sa resistensya sa mga legume sa mga pathogen ug peste", tan-awa ang tanan nga 5 ka artikulo
Ang hinungdan sa fungal plant disease necrosis nga Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary migamit og multi-tiered nga estratehiya aron mataptan ang lain-laing mga host nga tanom. Kini nga pagtuon nagsugyot sa paggamit sa diamine L-ornithine, usa ka non-protein amino acid nga nagpadasig sa synthesis sa ubang essential amino acids, isip alternatibong estratehiya sa pagdumala aron mapalambo ang molecular, physiological ug biochemical nga mga tubag sa Phaseolus vulgaris L. ngadto sa white mold nga gipahinabo sa Pseudomonas sclerotiorum. Ang mga in vitro nga eksperimento nagpakita nga ang L-ornithine nakapugong pag-ayo sa pagtubo sa mycelial sa S. pyrenoidosa sa usa ka dose-dependent nga paagi. Dugang pa, kini makapakunhod pag-ayo sa kagrabe sa white mold ubos sa mga kondisyon sa greenhouse. Dugang pa, ang L-ornithine nakapadasig sa pagtubo sa mga gitambalan nga tanom, nga nagpakita nga ang gisulayan nga konsentrasyon sa L-ornithine dili phytotoxic sa gitambalan nga mga tanom. Dugang pa, ang L-ornithine nagpalambo sa ekspresyon sa mga non-enzymatic antioxidants (total soluble phenolics ug flavonoids) ug enzymatic antioxidants (catalase (CAT), peroxidase (POX), ug polyphenol oxidase (PPO)), ug nagdugang sa ekspresyon sa tulo ka antioxidant-related genes (PvCAT1, PvSOD, ug PvGR). Dugang pa, ang in silico analysis nagpadayag sa presensya sa usa ka putative oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) protein sa S. sclerotiorum genome, nga susama kaayo sa oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) proteins sa Aspergillus fijiensis (AfOAH) ug Penicillium sp. (PlOAH) sa mga termino sa functional analysis, conserved domains, ug topology. Makapainteres, ang pagdugang sa L-ornithine sa potato dextrose broth (PDB) medium mikunhod pag-ayo sa ekspresyon sa SsOAH gene sa S. sclerotiorum mycelia. Susama, ang exogenous nga aplikasyon sa L-ornithine mikunhod pag-ayo sa ekspresyon sa SsOAH gene sa fungal mycelia nga nakolekta gikan sa mga gitambalan nga tanom. Sa katapusan, ang aplikasyon sa L-ornithine mikunhod pag-ayo sa oxalic acid secretion sa PDB medium ug sa mga nataptan nga dahon. Sa konklusyon, ang L-ornithine adunay hinungdanon nga papel sa pagmintinar sa redox status ingon man pagpausbaw sa depensa sa mga nataptan nga tanom. Ang mga resulta niini nga pagtuon makatabang sa pagpalambo sa mga inobatibo ug mahigalaon sa kalikopan nga mga pamaagi aron makontrol ang white mold ug makunhuran ang epekto niini sa produksiyon sa bean ug uban pang mga tanom.
Ang white mold, nga gipahinabo sa necrotrophic fungus nga Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, usa ka makadaot ug makapakunhod sa ani nga sakit nga naghatag ug seryosong hulga sa produksiyon sa tibuok kalibutan nga bean (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Ang Sclerotinia sclerotiorum usa sa pinakalisod nga kontrolon nga mga pathogen sa fungal plant nga dala sa yuta, nga adunay halapad nga host range nga sobra sa 600 ka klase sa tanom ug ang abilidad sa paspas nga pag-macerate sa mga tisyu sa host sa usa ka dili espesipikong paagi (Liang ug Rollins, 2018). Ubos sa dili maayo nga mga kondisyon, kini moagi sa usa ka kritikal nga hugna sa siklo sa kinabuhi niini, nga magpabilin nga dili aktibo sa dugay nga panahon isip itom, gahi, sama sa liso nga mga istruktura nga gitawag og 'sclerotia' sa yuta o isip puti, humok nga mga pagtubo sa mycelium o stem pith sa nataptan nga mga tanom (Schwartz et al., 2005). Ang S. sclerotiorum makahimo sa pagporma og sclerotia, nga nagtugot niini nga mabuhi sa mga nataptan nga uma sulod sa taas nga panahon ug magpadayon sa panahon sa sakit (Schwartz et al., 2005). Ang Sclerotia dato sa sustansya, mahimong magpabilin sa yuta sulod sa taas nga panahon, ug magsilbi nga pangunang inoculum alang sa sunod nga mga impeksyon (Schwartz et al., 2005). Ubos sa paborableng mga kondisyon, ang sclerotia moturok ug mopatunghag mga spore nga molupad sa hangin nga makatap sa tanang bahin sa tanom sa ibabaw sa yuta, lakip apan dili limitado sa mga bulak, punoan, o mga bunga (Schwartz et al., 2005).
Ang Sclerotinia sclerotiorum mogamit ug multi-tiered nga estratehiya aron mataptan ang mga tanom nga iyang gipuy-an, nga naglambigit ug sunod-sunod nga koordinadong mga panghitabo gikan sa sclerotial germination hangtod sa pag-uswag sa mga sintomas. Sa sinugdanan, ang S. sclerotiorum mopatunghag nagbitay nga mga spore (gitawag ug ascospores) gikan sa mga istruktura nga sama sa uhong nga gitawag ug apothecia, nga molupad sa hangin ug molambo ngadto sa dili motile nga sclerotia sa mga nataptan nga mga tinumpag sa tanom (Bolton et al., 2006). Ang fungus unya mopagawas ug oxalic acid, usa ka virulence factor, aron makontrol ang pH sa bungbong sa selula sa tanom, mapalambo ang enzymatic degradation ug tissue invasion (Hegedus ug Rimmer, 2005), ug mapugngan ang oxidative burst sa tanom nga iyang gipuy-an. Kini nga proseso sa acidification mopahuyang sa bungbong sa selula sa tanom, nga maghatag ug paborableng palibot alang sa normal ug episyente nga operasyon sa fungal cell wall degrading enzymes (CWDEs), nga magtugot sa pathogen nga mabuntog ang pisikal nga babag ug makasulod sa mga tisyu sa host (Marciano et al., 1983). Kung makasulod na, ang S. sclerotiorum mopagawas og daghang CWDEs, sama sa polygalacturonase ug cellulase, nga mopadali sa pagkaylap niini sa mga nataptan nga tisyu ug hinungdan sa tissue necrosis. Ang pag-uswag sa mga samad ug hyphal mats mosangpot sa kinaiya nga mga sintomas sa white mold (Hegedus ug Rimmer, 2005). Samtang, ang mga tanom nga host makaila sa pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) pinaagi sa pattern recognition receptors (PRRs), nga magpahinabo sa sunod-sunod nga mga signaling events nga sa katapusan mo-activate sa mga tubag sa depensa.
Bisan pa sa mga dekada nga paningkamot sa pagkontrol sa sakit, ang kakulang sa igong resistensyado nga germplasm nagpabilin sa bean, sama sa ubang komersyal nga mga tanom, tungod sa resistensya, pagkabuhi, ug pagkaangay sa pathogen. Busa, ang pagdumala sa sakit hilabihan ka mahagiton ug nanginahanglan usa ka integrated, multifaceted nga estratehiya nga naglakip sa kombinasyon sa mga pamaagi sa kultura, biological control, ug kemikal nga mga fungicide (O'Sullivan et al., 2021). Ang kemikal nga pagkontrol sa white mold mao ang labing epektibo tungod kay ang mga fungicide, kung gamiton sa husto ug sa husto nga oras, epektibo nga makakontrol sa pagkaylap sa sakit, makapakunhod sa kagrabe sa impeksyon, ug makapakunhod sa pagkawala sa ani. Bisan pa, ang sobra nga paggamit ug sobra nga pagsalig sa mga fungicide mahimong mosangpot sa pagtungha sa mga resistensyado nga strain sa S. sclerotiorum ug negatibo nga makaapekto sa mga dili target nga organismo, kahimsog sa yuta, ug kalidad sa tubig (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Busa, ang pagpangita og mga alternatibo nga mahigalaon sa kalikopan nahimong usa ka prayoridad.
Ang mga polyamine (PA), sama sa putrescine, spermidine, spermine, ug cadaverine, mahimong magsilbing maayong alternatibo batok sa mga pathogen sa tanom nga dala sa yuta, sa ingon hingpit o bahin nga pagkunhod sa paggamit sa mga delikado nga kemikal nga fungicide (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Sa mas taas nga mga tanom, ang mga PA nalambigit sa daghang mga proseso sa pisyolohikal lakip na, apan dili limitado sa, pagbahin sa selula, pagkalainlain, ug tubag sa abiotic ug biotic stress (Killiny ug Nehela, 2020). Mahimo silang molihok isip antioxidants, makatabang sa pag-scavenge sa reactive oxygen species (ROS), pagmintinar sa redox homeostasis (Nehela ug Killiny, 2023), pag-induce sa mga gene nga may kalabutan sa depensa (Romero et al., 2018), pag-regulate sa lainlaing mga metabolic pathway (Nehela ug Killiny, 2023), pag-modulate sa endogenous phytohormones (Nehela ug Killiny, 2019), pagtukod og systemic acquired resistance (SAR), ug pag-regulate sa plant-pathogen interactions (Nehela ug Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Angayan nga matikdan nga ang piho nga mga mekanismo ug papel sa mga PA sa depensa sa tanom managlahi depende sa mga espisye sa tanom, mga pathogen, ug mga kondisyon sa palibot. Ang labing daghan nga PA sa mga tanom gi-biosynthesize gikan sa essential polyamine L-ornithine (Killiny ug Nehela, 2020).
Ang L-ornithine adunay daghang papel sa pagtubo ug paglambo sa tanom. Pananglitan, ang mga nangaging pagtuon nagpakita nga sa humay (Oryza sativa), ang ornithine mahimong nalangkit sa pag-recycle sa nitroheno (Liu et al., 2018), ani sa humay, kalidad ug kahumot (Lu et al., 2020), ug tubag sa stress sa tubig (Yang et al., 2000). Dugang pa, ang exogenous nga aplikasyon sa L-ornithine nakapausbaw sa drought tolerance sa sugar beet (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) ug nakapamenos sa stress sa asin sa sibuyas (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ug Çavuşoǧlu, 2021) ug cashew (Anacardium occidentale) nga mga tanom (da Rocha et al., 2012). Ang potensyal nga papel sa L-ornithine sa abiotic stress defense mahimong tungod sa kalambigitan niini sa akumulasyon sa proline sa mga tanom nga gitambalan. Pananglitan, ang mga gene nga may kalabotan sa metabolismo sa proline, sama sa ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) ug proline dehydrogenase (ProDH1 ug ProDH2) nga mga gene, kaniadto gitaho nga nalambigit sa pagdepensa sa Nicotiana benthamiana ug Arabidopsis thaliana batok sa mga non-host nga Pseudomonas syringae strains (Senthil-Kumar ug Mysore, 2012). Sa laing bahin, ang fungal ornithine decarboxylase (ODC) gikinahanglan alang sa pagtubo sa pathogen (Singh et al., 2020). Ang pag-target sa ODC sa Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici pinaagi sa host-induced gene silencing (HIGS) nakapausbaw pag-ayo sa resistensya sa mga tanom nga kamatis sa Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Bisan pa, ang potensyal nga papel sa exogenous ornithine application batok sa biotic stresses sama sa phytopathogens wala pa kaayo gitun-an. Mas importante, ang mga epekto sa ornithine sa resistensya sa sakit ug ang nalangkit nga biochemical ug physiological nga mga panghitabo wala pa kaayo masusi.
Ang pagsabot sa pagkakomplikado sa impeksyon sa S. sclerotiorum sa mga legume importante alang sa pagpalambo sa epektibo nga mga estratehiya sa pagkontrol. Niini nga pagtuon, among gituyo nga mailhan ang potensyal nga papel sa diamine L-ornithine isip usa ka hinungdanon nga hinungdan sa pagpalambo sa mga mekanismo sa depensa ug resistensya sa mga tanom nga legume sa impeksyon sa Sclerotinia sclerotiorum. Among gihunahuna nga, dugang sa pagpalambo sa mga tubag sa depensa sa mga nataptan nga tanom, ang L-ornithine adunay usab hinungdanon nga papel sa pagmintinar sa redox status. Among gisugyot nga ang potensyal nga mga epekto sa L-ornithine adunay kalabotan sa regulasyon sa enzymatic ug non-enzymatic antioxidant defense mechanisms ug pagpanghilabot sa fungal pathogenicity/virulence factors ug mga kaubang protina. Kini nga doble nga gamit sa L-ornithine naghimo niini nga usa ka maayong kandidato alang sa usa ka malungtarong estratehiya aron makunhuran ang epekto sa white mold ug mapalambo ang resistensya sa komon nga mga tanom nga legume niining kusgan nga fungal pathogen. Ang mga resulta sa karon nga pagtuon makatabang sa pagpalambo sa mga bag-o ug mahigalaon sa kalikopan nga mga pamaagi aron makontrol ang white mold ug makunhuran ang epekto niini sa produksiyon sa legume.
Niini nga pagtuon, usa ka daling maapektuhan nga klase sa komon nga liso, ang Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ang gigamit isip eksperimental nga materyal. Ang himsog nga mga liso gihatag sa Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypt. Lima ka liso ang gipugas sa mga plastik nga kaldero (sulod nga diyametro 35 cm, giladmon 50 cm) nga gisudlan sa yuta nga nataptan sa S. sclerotiorum ubos sa mga kondisyon sa greenhouse (25 ± 2 °C, relatibong humidity 75 ± 1%, 8 ka oras nga kahayag/16 ka oras nga kangitngit). Sa 7–10 ka adlaw human sa pagpugas (DPS), ang mga semilya gipanipis aron magbilin lamang og duha ka semilya nga parehas og pagtubo ug tulo ka hingpit nga mibukad nga mga dahon sa matag kaldero. Ang tanang mga tanom nga gibutang sa kaldero gibisbisan kausa matag duha ka semana ug gi-abonohan kada bulan sa girekomenda nga rate alang sa gihatag nga klase.
Aron maandam ang 500 mg/L nga konsentrasyon sa L-ornithinediamine (nailhan usab nga (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), 50 mg ang unang gitunaw sa 100 mL nga sterile distilled water. Ang stock solution gi-dilute dayon ug gigamit sa sunod nga mga eksperimento. Sa laktod nga pagkasulti, unom ka serye sa L-ornithine concentrations (12.5, 25, 50, 75, 100, ug 125 mg/L) ang gisulayan in vitro. Dugang pa, ang sterile distilled water gigamit isip negative control (Mock) ug ang commercial fungicide nga "Rizolex-T" 50% wettable powder (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) gigamit isip positive control. Ang komersyal nga fungicide nga "Rizolex-T" gisulayan in vitro sa lima ka konsentrasyon (2, 4, 6, 8 ug 10 mg/L).
Ang mga sample sa komon nga mga punoan ug pod sa bean nga nagpakita sa tipikal nga mga sintomas sa puti nga agup-op (infestation rate: 10–30%) gikolekta gikan sa mga komersyal nga umahan. Bisan kung kadaghanan sa mga nataptan nga materyal sa tanom giila pinaagi sa mga espisye/baryo (susceptible commercial variety nga Giza 3), ang uban, labi na kadtong nakuha gikan sa lokal nga merkado, gikan sa wala mailhi nga mga espisye. Ang nakolekta nga nataptan nga mga materyal una nga gi-disinfect sa ibabaw gamit ang 0.5% sodium hypochlorite solution sulod sa 3 ka minuto, dayon gihugasan sa makadaghan nga higayon gamit ang sterile distilled water ug gipahiran gamit ang sterile filter paper aron makuha ang sobra nga tubig. Ang mga nataptan nga organo giputol dayon ngadto sa gagmay nga mga piraso gikan sa tunga nga tisyu (taliwala sa himsog ug nataptan nga mga tisyu), gipatubo sa potato dextrose agar (PDA) medium ug gi-incubate sa 25 ± 2 °C nga adunay 12 ka oras nga light/12 ka oras nga dark cycle sulod sa 5 ka adlaw aron mapukaw ang pagporma sa sclerotia. Ang mycelial tip method gigamit usab sa pagputli sa fungal isolates gikan sa gisagol o kontaminado nga mga kultura. Ang giputli nga fungal isolate unang giila base sa cultural morphological characteristics niini ug dayon gikumpirma nga S. sclerotiorum base sa microscopic features. Sa katapusan, ang tanang purified isolates gisulayan para sa pathogenicity sa susceptible common bean cultivar nga Giza 3 aron matuman ang Koch's postulates.
Dugang pa, ang labing invasive nga S. sclerotiorum isolate (isolate #3) dugang nga gikumpirma base sa internal transcribed spacer (ITS) sequencing sama sa gihulagway ni White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Sa laktod nga pagkasulti, ang mga isolate gipatubo sa potato dextrose broth (PDB) ug gi-incubate sa 25 ± 2 °C sulod sa 5–7 ka adlaw. Ang fungal mycelium gikolekta dayon, gisala pinaagi sa cheesecloth, gihugasan kaduha gamit ang sterile nga tubig, ug gipauga gamit ang sterile nga filter paper. Ang genomic DNA gi-isolate gamit ang Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Ang rehiyon sa ITS rDNA gi-amplify dayon gamit ang espesipikong pares sa primer nga ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; gilauman nga gidak-on: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Ang giputli nga mga produkto sa PCR gisumite alang sa sequencing (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Ang mga sequence sa ITS rDNA gi-sequence sa bidirectionally gamit ang pamaagi sa Sanger sequencing. Ang gitigom nga mga sequence sa query gitandi dayon sa pinakabag-o nga datos sa GenBank ug sa National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) gamit ang BLASTn software. Ang sequence sa query gitandi sa 20 pa ka S. sclerotiorum strains/isolates nga nakuha gikan sa pinakabag-o nga datos sa NCBI GenBank (Supplementary Table S1) gamit ang ClustalW sa Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; bersyon 11) (Kumar et al., 2024). Ang pag-analisa sa ebolusyon gihimo gamit ang maximum likelihood method ug ang general time-reversible nucleotide substitution model (Nei ug Kumar, 2000). Ang kahoy nga adunay pinakataas nga log-likelihood gipakita. Ang inisyal nga kahoy para sa heuristic search gipili pinaagi sa pagpili sa kahoy nga adunay mas taas nga log-likelihood tali sa neighbor-joining (NJ) tree (Kumar et al., 2024) ug sa maximum parsimony (MP) tree. Ang NJ tree gitukod gamit ang pairwise distance matrix nga gikalkulo gamit ang general time-reversible model (Nei ug Kumar, 2000).
Ang antibacterial nga kalihokan sa L-ornithine ug ang bactericide nga "Rizolex-T" gitino in vitro pinaagi sa agar diffusion method. Pamaagi: Kuhaa ang saktong gidaghanon sa stock solution sa L-ornithine (500 mg/L) ug isagol kini pag-ayo sa 10 ml sa PDA nutrient medium aron maandam ang mga solusyon nga adunay katapusang konsentrasyon nga 12.5, 25, 50, 75, 100 ug 125 mg/L, matag usa. Lima ka konsentrasyon sa fungicide nga "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 ug 10 mg/L) ug sterile distilled water ang gigamit isip control. Human molig-on ang medium, usa ka bag-ong giandam nga mycelial plug sa Sclerotinia sclerotiorum culture, 4 mm ang diametro, ang gibalhin sa tunga sa Petri dish ug gi-culture sa 25±2°C hangtud nga ang mycelium mitabon sa tibuok control Petri dish, pagkahuman niini ang pagtubo sa fungus natala. Kwentaha ang porsyento sa pagpugong sa radial growth sa S. sclerotiorum gamit ang equation 1:
Ang eksperimento gisubli kaduha, nga adunay unom ka biyolohikal nga replika alang sa matag kontrol/eksperimental nga grupo ug lima ka kaldero (duha ka tanom matag kaldero) alang sa matag biyolohikal nga replika. Ang matag biyolohikal nga replika gisusi kaduha (duha ka teknikal nga replika) aron masiguro ang katukma, kasaligan, ug pagka-masubli sa mga resulta sa eksperimento. Dugang pa, gigamit ang probit regression analysis aron makalkulo ang half-maximal inhibitory concentration (IC50) ug IC99 (Prentice, 1976).
Aron masusi ang potensyal sa L-ornithine ubos sa mga kondisyon sa greenhouse, duha ka sunod-sunod nga eksperimento sa kaldero ang gihimo. Sa laktod nga pagkasulti, ang mga kaldero gipuno sa isterilisado nga yuta nga lapok-balas (3:1) ug gi-inoculate sa bag-ong giandam nga culture sa S. sclerotiorum. Una, ang labing invasive nga isolate sa S. sclerotiorum (isolate #3) gi-culture pinaagi sa pagputol sa usa ka sclerotium sa tunga, pagbutang niini nga nag-atubang sa usa ka PDA ug pag-incubate sa 25°C sa kanunay nga kangitngit (24 oras) sulod sa 4 ka adlaw aron mapukaw ang pagtubo sa mycelial. Upat ka 5 mm diameter nga agar plugs ang gikuha gikan sa leading edge ug gi-inoculate sa 100 g nga sterile nga sagol nga trigo ug rice bran (1:1, v/v) ug ang tanan nga flasks gi-incubate sa 25 ± 2 °C ubos sa 12 ka oras nga light/12 ka oras nga dark cycle sulod sa 5 ka adlaw aron mapukaw ang pagporma sa sclerotia. Ang sulod sa tanan nga flasks gisagol pag-ayo aron masiguro ang homogeneity sa dili pa idugang ang yuta. Dayon, 100 g sa sagol nga bran nga nagkolonisa sa mga tanom ang gidugang sa matag kaldero aron masiguro ang makanunayong konsentrasyon sa mga pathogen. Ang mga kaldero nga gibakunahan gibisbisan aron mapadali ang pagtubo sa fungus ug gibutang sa mga kondisyon sa greenhouse sulod sa 7 ka adlaw.
Lima ka liso sa Giza 3 nga klase ang gipugas sa matag kaldero. Para sa mga kaldero nga gitambalan og L-ornithine ug fungicide nga Rizolex-T, ang isterilisadong mga liso unang gihumol sulod sa duha ka oras sa tubigon nga solusyon sa duha ka compound nga adunay katapusang konsentrasyon sa IC99 nga mga 250 mg/L ug 50 mg/L, matag usa, ug dayon gipauga sa hangin sulod sa usa ka oras sa dili pa ipugas. Sa laing bahin, ang mga liso gihumol sa isterilisadong distilled water isip negatibo nga kontrol. Human sa 10 ka adlaw, sa dili pa ang unang pagbisibis, ang mga semilya gipanipis, nga nagbilin lamang og duha ka limpyo nga semilya sa matag kaldero. Dugang pa, aron masiguro ang impeksyon sa S. sclerotiorum, ang mga punoan sa tanom nga bean sa parehas nga yugto sa paglambo (10 ka adlaw) giputol sa duha ka lainlaing lokasyon gamit ang isterilisadong scalpel ug gibana-bana nga 0.5 g sa kolonisadong sagol nga bran ang gibutang sa matag samad, gisundan sa taas nga humidity aron mapukaw ang impeksyon ug pag-uswag sa sakit sa tanan nga gibakunahan nga mga tanom. Ang mga control plants gisamaran usab ug parehas nga gidaghanon (0.5 g) sa sterile, wala ma-kolonisa nga bran mixture ang gibutang sa samad ug gimentinar ubos sa taas nga humidity aron masundog ang palibot para sa pag-uswag sa sakit ug masiguro ang pagkaparehas tali sa mga treatment group.
Pamaagi sa Pagtambal: Ang mga semilya sa bean gibisbisan og 500 ml nga tubigon nga solusyon sa L-ornithine (250 mg/l) o ang fungicide nga Rizolex-T (50 mg/l) pinaagi sa pag-irigasyon sa yuta, dayon ang pagtambal gisubli tulo ka beses sa gilay-on nga 10 ka adlaw. Ang mga kontrol nga gitambalan og placebo gibisbisan og 500 ml nga sterile distilled water. Ang tanan nga pagtambal gihimo ubos sa mga kondisyon sa greenhouse (25 ± 2°C, 75 ± 1% relative humidity, ug photoperiod nga 8 ka oras nga kahayag/16 ka oras nga kangitngit). Ang tanan nga mga kaldero gibisbisan og duha ka semana ug gitambalan kada bulan gamit ang balanse nga abono sa NPK (20-20-20, nga adunay 3.6% sulfur ug TE microelements; Zain Seeds, Egypt) sa konsentrasyon nga 3–4 g/l pinaagi sa foliar spraying sumala sa mga rekomendasyon alang sa piho nga barayti ug sa mga instruksyon sa tiggama. Gawas kon lahi ang giingon, ang hingpit nga midako nga hamtong nga mga dahon (ika-2 ug ika-3 nga dahon gikan sa ibabaw) gikolekta gikan sa matag biological replicate sa 72 ka oras human sa pagtambal (hpt), gi-homogenize, gi-pool, ug gitipigan sa -80 °C alang sa dugang nga mga pag-analisa lakip na, apan dili limitado sa, in situ histochemical localization sa oxidative stress indicators, lipid peroxidation, enzymatic ug non-enzymatic antioxidants, ug gene expression.
Ang intensidad sa impeksyon sa white mold gisusi kada semana 21 ka adlaw human sa inoculation (dpi) gamit ang sukdanan nga 1–9 (Supplementary Table S2) base sa Petzoldt ug Dickson scale (1996) nga giusab ni Teran et al. (2006). Sa laktod nga pagkasulti, ang mga punoan ug sanga sa mga tanom nga bean gisusi sugod sa punto sa inoculation aron masundan ang pag-uswag sa mga lesion subay sa mga internode ug node. Ang distansya sa lesion gikan sa punto sa inoculation hangtod sa pinakalayo nga punto subay sa punoan o sanga gisukod dayon ug ang score nga 1–9 gi-assign base sa lokasyon sa lesion, diin (1) nagpakita nga walay makita nga impeksyon duol sa punto sa inoculation ug (2–9) nagpakita sa hinay-hinay nga pagtaas sa gidak-on sa lesion ug pag-uswag subay sa mga node/internode (Supplementary Table S2). Ang intensidad sa impeksyon sa white mold gi-convert dayon ngadto sa porsyento gamit ang pormula 2:
Dugang pa, ang area under the disease progression curve (AUDPC) gikalkulo gamit ang pormula (Shaner ug Finney, 1977), nga bag-o lang gi-adapt para sa white rot sa common bean (Chauhan et al., 2020) gamit ang equation 3:
Diin ang Yi = kagrabe sa sakit sa panahon nga ti, Yi+1 = kagrabe sa sakit sa sunod nga panahon ti+1, ti = oras sa unang pagsukod (sa mga adlaw), ti+1 = oras sa sunod nga pagsukod (sa mga adlaw), n = kinatibuk-ang gidaghanon sa mga punto sa oras o mga punto sa obserbasyon. Ang mga parametro sa pagtubo sa tanom nga bean lakip ang gitas-on sa tanom (cm), gidaghanon sa mga sanga matag tanom, ug gidaghanon sa mga dahon matag tanom girekord kada semana sulod sa 21 ka adlaw sa tanang biological replicates.
Sa matag biological replicate, ang mga sample sa dahon (ikaduha ug ikatulo nga hingpit nga naugmad nga mga dahon gikan sa ibabaw) gikolekta sa ika-45 nga adlaw human sa pagtambal (15 ka adlaw human sa katapusang pagtambal). Ang matag biological replicate gilangkoban sa lima ka kaldero (duha ka tanom matag kaldero). Mga 500 mg sa dinugmok nga tisyu ang gigamit alang sa pagkuha sa mga photosynthetic pigment (chlorophyll a, chlorophyll b ug carotenoids) gamit ang 80% acetone sa 4 °C sa kangitngit. Human sa 24 ka oras, ang mga sample gi-centrifuge ug ang supernatant gikolekta alang sa pagtino sa chlorophyll a, chlorophyll b ug carotenoid contents nga colorimetrically gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) sumala sa pamaagi sa (Lichtenthaler, 1987) pinaagi sa pagsukod sa absorbance sa tulo ka lain-laing wavelengths (A470, A646 ug A663 nm). Sa katapusan, ang sulod sa mga photosynthetic pigment gikalkulo gamit ang mosunod nga mga pormula 4–6 nga gihulagway ni Lichtenthaler (1987).
Sa 72 ka oras human sa pagtambal (hpt), ang mga dahon (ikaduha ug ikatulo nga hingpit nga naugmad nga mga dahon gikan sa ibabaw) gikolekta gikan sa matag biological replicate alang sa in situ histochemical localization sa hydrogen peroxide (H2O2) ug superoxide anion (O2•−). Ang matag biological replicate gilangkoban sa lima ka mga kaldero (duha ka tanom matag kaldero). Ang matag biological replicate gi-analisa sa duplicate (duha ka teknikal nga replicate) aron masiguro ang katukma, kasaligan ug reproducibility sa pamaagi. Ang H2O2 ug O2•− gitino gamit ang 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) o nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), matag usa, nga nagsunod sa mga pamaagi nga gihulagway ni Romero-Puertas et al. (2004) ug Adam et al. (1989) nga adunay gagmay nga mga pagbag-o. Para sa histochemical localization sa H2O2 in situ, ang mga leaflet gi-vacuum infiltration gamit ang 0.1% DAB sa 10 mM Tris buffer (pH 7.8) ug dayon gi-incubate sa temperatura sa kwarto ubos sa kahayag sulod sa 60 minutos. Ang mga leaflet gi-bleach sa 0.15% (v/v) TCA sa 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ug dayon gi-expose sa kahayag hangtod nga kini mongitngit. Sa susama, ang mga valve gi-vacuum infiltration gamit ang 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) nga adunay 0.1 w/v % HBT para sa histochemical localization sa O2•− in situ. Ang mga leaflet gi-incubate sa kahayag sa temperatura sa kwarto sulod sa 20 minutos, dayon gi-bleach sama sa ibabaw, ug dayon gidan-agan hangtod nga makita ang mga dark blue/violet spots. Ang kakusog sa resulta nga brown (isip H2O2 indicator) o blue-violet (isip O2•− indicator) nga kolor gisusi gamit ang Fiji nga bersyon sa image processing package nga ImageJ (http://fiji.sc; gi-access niadtong Marso 7, 2024).
Ang Malondialdehyde (MDA; isip marker sa lipid peroxidation) gitino sumala sa pamaagi ni Du ug Bramlage (1992) nga adunay gamay nga mga pagbag-o. Ang mga dahon gikan sa matag biological replicate (ikaduha ug ikatulo nga hingpit nga naugmad nga mga dahon gikan sa ibabaw) gikolekta 72 ka oras pagkahuman sa pagtambal (hpt). Ang matag biological replicate naglakip sa lima ka mga kaldero (duha ka tanum matag kaldero). Ang matag biological replicate gisusi sa doble (duha ka teknikal nga replicate) aron masiguro ang katukma, kasaligan ug pagka-masubli sa pamaagi. Sa laktod nga pagkasulti, 0.5 g nga giniling nga tisyu sa dahon ang gigamit alang sa MDA extraction nga adunay 20% trichloroacetic acid (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) nga adunay 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Ang MDA content sa supernatant gitino dayon pinaagi sa colorimetrically pinaagi sa pagsukod sa absorbance sa 532 ug 600 nm gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) ug dayon gipahayag isip nmol g−1 FW.
Alang sa pagtimbang-timbang sa mga non-enzymatic ug enzymatic antioxidants, ang mga dahon (ikaduha ug ikatulo nga hingpit nga naugmad nga mga dahon gikan sa ibabaw) gikolekta gikan sa matag biological replicate 72 ka oras pagkahuman sa pagtambal (hpt). Ang matag biological replicate gilangkoban sa lima ka mga kaldero (duha ka tanum matag kaldero). Ang matag biological sample gisusi sa doble (duha ka teknikal nga sample). Duha ka dahon ang gigaling gamit ang liquid nitrogen ug gigamit direkta alang sa pagtino sa enzymatic ug non-enzymatic antioxidants, total amino acids, proline content, gene expression, ug oxalate quantification.
Ang kinatibuk-ang matunaw nga phenolics gitino gamit ang Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) nga adunay gamay nga mga pagbag-o sa pamaagi nga gihulagway ni Kahkonen et al. (1999). Sa laktod nga pagkasulti, gibana-bana nga 0.1 g sa homogenized nga tisyu sa dahon ang gikuha gamit ang 20 ml 80% methanol sa kangitngit sulod sa 24 oras ug ang supernatant gikolekta human sa centrifugation. 0.1 ml sa sample extract gisagol sa 0.5 ml Folin-Ciocalteu reagent (10%), giuyog sulod sa 30 segundos ug gibiyaan sa kangitngit sulod sa 5 minuto. Dayon ang 0.5 ml sa 20% sodium carbonate solution (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) gidugang sa matag tubo, gisagol pag-ayo ug gi-incubate sa temperatura sa kwarto sa kangitngit sulod sa 1 ka oras. Human sa incubation, ang absorbance sa reaction mixture gisukod sa 765 nm gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Ang konsentrasyon sa total soluble phenols sa sample extracts gitino gamit ang gallic acid calibration curve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ug gipahayag isip milligrams sa gallic acid equivalent kada gramo sa fresh weight (mg GAE g-1 fresh weight).
Ang kinatibuk-ang soluble flavonoid content gitino sumala sa pamaagi ni Djeridane et al. (2006) nga adunay gamay nga mga pagbag-o. Sa laktod nga pagkasulti, ang 0.3 ml sa nahisgutang methanol extract gisagol sa 0.3 ml nga 5% aluminum chloride solution (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), kusganong gikutaw ug dayon gi-incubate sa temperatura sa kwarto sulod sa 5 ka minuto, gisundan sa pagdugang sa 0.3 ml nga 10% potassium acetate solution (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), gisagol pag-ayo ug gi-incubate sa temperatura sa kwarto sulod sa 30 ka minuto sa kangitngit. Human sa incubation, ang absorbance sa reaction mixture gisukod sa 430 nm gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Ang konsentrasyon sa kinatibuk-ang soluble flavonoids sa sample extracts gitino gamit ang rutin calibration curve (TCI America, Portland, OR, USA) ug dayon gipahayag isip milligrams sa rutin equivalent kada gramo sa fresh weight (mg RE g-1 fresh weight).
Ang kinatibuk-ang free amino acid content sa mga dahon sa liso gitino gamit ang usa ka giusab nga ninhydrin reagent (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) base sa pamaagi nga gisugyot ni Yokoyama ug Hiramatsu (2003) ug giusab ni Sun et al. (2006). Sa laktod nga pagkasulti, 0.1 g sa giniling nga tisyu ang gikuha gamit ang pH 5.4 buffer, ug 200 μL sa supernatant ang gi-react sa 200 μL sa ninhydrin (2%) ug 200 μL sa pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), gi-incubate sa nagbukal nga tubig sulod sa 30 minutos, dayon gipabugnaw ug gisukod sa 580 nm gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Sa laing bahin, ang proline gitino gamit ang pamaagi ni Bates (Bates et al., 1973). Ang proline gi-extract gamit ang 3% sulfosalicylic acid (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ug human sa centrifugation, 0.5 ml sa supernatant gisagol sa 1 ml glacial acetic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ug ninhydrin reagent, gi-incubate sa 90°C sulod sa 45 min, gipabugnaw ug gisukod sa 520 nm gamit ang parehas nga spectrophotometer sama sa nahisgotan sa ibabaw. Ang total free amino acids ug proline sa leaf extracts gitino gamit ang glycine ug proline calibration curves (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), matag usa, ug gipahayag isip mg/g fresh weight.
Aron mahibal-an ang enzymatic activity sa antioxidant enzymes, gibana-bana nga 500 mg nga homogenized tissue ang gi-extract gamit ang 3 ml nga 50 mM Tris buffer (pH 7.8) nga adunay 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ug 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), gi-centrifuge sa 10,000 × g sulod sa 20 min ubos sa refrigeration (4 °C), ug ang supernatant (crude enzyme extract) gikolekta (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ang Catalase (CAT) gi-react dayon gamit ang 2 ml nga 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ug 100 μl nga 269 mM H2O2 solution aron mahibal-an ang enzymatic activity niini sumala sa pamaagi ni Aebi (1984) nga adunay gamay nga mga pagbag-o (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ang Guaiacol-dependent peroxidase (POX) enzymatic activity gitino gamit ang pamaagi ni Harrach et al. (2009). (2008) nga adunay gagmay nga mga pagbag-o (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ug ang enzymatic activity sa polyphenol oxidase (PPO) natino human sa reaksyon sa 2.2 ml nga 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), 100 μl nga guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) ug 100 μl nga 12 mM H2O2. Ang pamaagi gamay nga giusab gikan sa (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ang assay gihimo human sa reaksyon sa 3 ml nga catechol solution (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) nga bag-ong giandam sa 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). Ang kalihokan sa CAT gisukod pinaagi sa pagmonitor sa pagkadunot sa H2O2 sa 240 nm (A240), ang kalihokan sa POX gisukod pinaagi sa pagmonitor sa pagtaas sa absorbance sa 436 nm (A436), ug ang kalihokan sa PPO gisukod pinaagi sa pagrekord sa mga pag-usab-usab sa absorbance sa 495 nm (A495) matag 30 segundos sulod sa 3 ka minuto gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu, Japan).
Gigamit ang real-time RT-PCR aron mahibal-an ang lebel sa transcript sa tulo ka mga gene nga may kalabutan sa antioxidant, lakip ang peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), ug glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), sa mga dahon sa bean (ang ikaduha ug ikatulo nga hingpit nga naugmad nga mga dahon gikan sa ibabaw) 72 ka oras pagkahuman sa katapusang pagtambal. Sa laktod nga pagkasulti, ang RNA gi-isolate gamit ang Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) sumala sa protocol sa tiggama. Dayon, ang cDNA gi-synthesize gamit ang TOP script™ cDNA Synthesis Kit sumala sa mga instruksyon sa tiggama. Ang mga primer sequence sa tulo ka mga gene sa ibabaw gilista sa Supplementary Table S3. Ang PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) gigamit isip housekeeping gene ug ang relative gene expression gikalkulo gamit ang 2-ΔΔCT method (Livak ug Schmittgen, 2001). Gipakita ang kalig-on sa Actin ubos sa biotic stress (dili compatible nga interaksyon tali sa komon nga mga legume ug sa anthracnose fungus nga Colletotrichum lindemuthianum) ug abiotic stress (hulaw, kaasinan, ubos nga temperatura) (Borges et al., 2012).
Sa sinugdanan, naghimo kami og genome-wide in silico analysis sa oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) proteins sa S. sclerotiorum gamit ang protein-protein BLAST tool (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Sa laktod nga pagkasulti, gigamit namo ang OAH gikan sa Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) ug Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 amino acids) isip query sequences aron ma-map ang homologous protein sa S. sclerotiorum (taxide: 5180). Ang BLASTp gihimo batok sa pinakabag-o nga magamit nga datos sa genome sa S. sclerotiorum sa GenBank sa website sa National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Dugang pa, ang gitagna nga OAH gene gikan sa S. sclerotiorum (SsOAH) ug ang evolutionary analysis ug phylogenetic tree sa AfOAH gikan sa A. fijiensis CBS 313.89 ug PlOAH gikan sa P. lagena gi-infer gamit ang maximum likelihood method sa MEGA11 (Tamura et al., 2021) ug ang JTT matrix-based model (Jones et al., 1992). Ang phylogenetic tree gihiusa sa multiple alignment analysis sa protein sequences sa tanang gitagna nga OAH genes (SsOAH) gikan sa S. sclerotiorum ug ang query sequence gamit ang Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ug Agarwala, 2007). Dugang pa, ang labing maayong pagkapares nga amino acid sequences sa SsOAH gikan sa S. sclerotiorum gi-align sa query sequences (AfOAH ug PlOAH) (Larkin et al., 2007) gamit ang ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ug ang mga conserved regions sa alignment gi-visualize gamit ang ESPript tool (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Dugang pa, ang gitagna nga functional representative domains ug conserved sites sa S. sclerotiorum SsOAH interactive nga giklasipikar ngadto sa lain-laing mga pamilya gamit ang InterPro tool (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Sa katapusan, ang three-dimensional (3D) structure modeling sa gitagna nga S. sclerotiorum SsOAH gihimo gamit ang Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ug gi-validate gamit ang SWISS-MODEL server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Ang gitagna nga tulo-ka-dimensyon nga mga istruktura (PDB format) interactive nga gi-visualize gamit ang UCSF-Chimera package (bersyon 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Gigamit ang quantitative real-time fluorescence PCR aron mahibal-an ang transcriptional level sa oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) sa mycelia sa Sclerotinia sclerotiorum. Sa laktod nga pagkasulti, ang S. sclerotiorum gi-inoculate sa usa ka flask nga adunay PDB ug gibutang sa usa ka shaking incubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) sa 25 ± 2 °C sulod sa 24 oras sa 150 rpm ug sa kanunay nga kangitngit (24 oras) aron madasig ang pagtubo sa mycelial. Pagkahuman, ang mga selula gitambalan gamit ang L-ornithine ug ang fungicide nga Rizolex-T sa katapusang konsentrasyon sa IC50 (gibana-bana nga 40 ug 3.2 mg/L, matag usa) ug dayon gi-culture sulod sa laing 24 oras ubos sa parehas nga mga kondisyon. Human sa incubation, ang mga culture gi-centrifuge sa 2500 rpm sulod sa 5 minutos ug ang supernatant (fungal mycelium) gikolekta para sa gene expression analysis. Sa susama, ang fungal mycelium gikolekta sa 0, 24, 48, 72, 96, ug 120 ka oras human sa impeksyon gikan sa mga nataptan nga tanom nga nakaporma og white mold ug cottony mycelium sa ibabaw sa mga nataptan nga tisyu. Ang RNA gikuha gikan sa fungal mycelium ug dayon ang cDNA gi-synthesize sama sa gihulagway sa ibabaw. Ang mga primer sequence para sa SsOAH gilista sa Supplementary Table S3. Ang SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) gigamit isip housekeeping gene, ug ang relative gene expression gikalkulo gamit ang 2-ΔΔCT method (Livak ug Schmittgen, 2001).
Ang oxalic acid gitino sa potato dextrose broth (PDB) ug mga sample sa tanom nga adunay fungal pathogen nga Sclerotinia sclerotiorum sumala sa pamaagi ni Xu ug Zhang (2000) nga adunay gamay nga mga pagbag-o. Sa laktod nga pagkasulti, ang mga isolate sa S. sclerotiorum gi-inoculate sa mga flasks nga adunay PDB ug dayon gi-culture sa usa ka shaking incubator (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) sa 150 rpm sa 25 ± 2 °C sulod sa 3-5 ka adlaw sa kanunay nga kangitngit (24 oras) aron mapukaw ang pagtubo sa mycelial. Pagkahuman sa incubation, ang fungal culture unang gisala pinaagi sa Whatman #1 filter paper ug dayon gi-centrifuge sa 2500 rpm sulod sa 5 minuto aron makuha ang nahabilin nga mycelium. Ang supernatant gikolekta ug gitipigan sa 4°C alang sa dugang nga quantitative determination sa oxalate. Alang sa pag-andam sa mga sample sa tanom, gibana-bana nga 0.1 g nga mga tipik sa tisyu sa tanom ang gikuha sa tulo ka beses gamit ang distilled water (2 ml matag higayon). Ang mga sample gi-centrifuge dayon sa 2500 rpm sulod sa 5 minutos, ang supernatant gi-dry filter gamit ang Whatman No. 1 filter paper ug gikolekta para sa dugang nga pag-analisar.
Para sa quantitative analysis sa oxalic acid, ang reaction mixture giandam sa usa ka glass stoppered tube sa mosunod nga han-ay: 0.2 ml nga sample (o PDB culture filtrate o oxalic acid standard solution), 0.11 ml nga bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml nga 1 M sulfuric acid (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ug 0.176 ml nga 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), ug dayon ang solusyon gi-dilute ngadto sa 4.8 ml gamit ang distilled water, gisagol pag-ayo ug gibutang dayon sa 60 °C water bath. Human sa 10 minutos, ang reaksyon gipahunong pinaagi sa pagdugang og 0.5 ml nga sodium hydroxide solution (NaOH; 0.75 M). Ang absorbance (A600) sa reaction mixture gisukod sa 600 nm gamit ang UV-160 spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Ang PDB ug distilled water gigamit isip kontrol para sa quantification sa culture filtrates ug plant samples, matag usa. Ang oxalic acid concentrations sa culture filtrates, nga gipahayag isip micrograms sa oxalic acid kada milliliter sa PDB medium (μg.mL−1), ug sa leaf extracts, nga gipahayag isip micrograms sa oxalic acid kada gram sa fresh weight (μg.g−1 FW), gitino gamit ang oxalic acid calibration curve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Sa tibuok pagtuon, ang tanang eksperimento gidisenyo sa usa ka hingpit nga randomized design (CRD) nga adunay unom ka biological replicates matag treatment ug lima ka pot matag biological replicate (duha ka tanom matag pot) gawas kon lahi ang giingon. Ang mga biological replicates gi-analisa sa doble (duha ka teknikal nga replicates). Gigamit ang mga teknikal nga replicates aron masusi ang reproducibility sa parehas nga eksperimento apan wala gigamit sa statistical analysis aron malikayan ang spurious replicates. Ang datos gi-analisa sa istatistika gamit ang analysis of variance (ANOVA) gisundan sa Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD) test (p ≤ 0.05). Para sa mga in vitro experiments, ang mga kantidad sa IC50 ug IC99 gikalkulo gamit ang probit model ug gikalkulo ang 95% confidence intervals.
Usa ka kinatibuk-an nga upat ka isolates ang nakolekta gikan sa lain-laing mga umahan sa soybean sa El Ghabiya Governorate, Egypt. Sa PDA medium, ang tanang isolates nakamugna og creamy white mycelium nga dali nga nahimong puti nga sama sa gapas (Figure 1A) ug dayon beige o brown sa yugto sa sclerotium. Ang mga Sclerotia kasagaran dasok, itom, lingin o dili regular ang porma, 5.2 ngadto sa 7.7 mm ang gitas-on ug 3.4 ngadto sa 5.3 mm ang diametro (Figure 1B). Bisan tuod upat ka isolates ang nakaugmad og marginal pattern sa sclerotia sa ngilit sa culture medium human sa 10–12 ka adlaw nga incubation sa 25 ± 2 °C (Fig. 1A), ang gidaghanon sa sclerotia matag plato lahi kaayo taliwala kanila (P < 0.001), diin ang isolate 3 adunay pinakataas nga gidaghanon sa sclerotia (32.33 ± 1.53 sclerotia matag plato; Fig. 1C). Susama, ang isolate #3 nakamugna og mas daghang oxalic acid sa PDB kaysa sa ubang mga isolate (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Ang Isolate #3 nagpakita sa tipikal nga morphological ug microscopic nga mga kinaiya sa phytopathogenic fungus nga Sclerotinia sclerotiorum. Pananglitan, sa PDA, ang mga kolonya sa isolate #3 paspas nga mitubo, creamy white (Figure 1A), reverse beige o light salmon yellow-brown, ug nagkinahanglan og 6-7 ka adlaw sa 25 ± 2°C aron hingpit nga matabonan ang nawong sa usa ka 9 cm nga diametro nga plato. Base sa nahisgutang morphological ug microscopic nga mga kinaiya, ang isolate #3 nailhan nga Sclerotinia sclerotiorum.
Hulagway 1. Mga kinaiya ug pathogenicity sa S. sclerotiorum isolates gikan sa komon nga mga tanom nga legume. (A) Pagtubo sa mycelial sa upat ka S. sclerotiorum isolates sa PDA medium, (B) sclerotia sa upat ka S. sclerotiorum isolates, (C) gidaghanon sa sclerotia (kada plato), (D) oxalic acid secretion sa PDB medium (μg.mL−1), ug (E) kagrabe sa sakit (%) sa upat ka S. sclerotiorum isolates sa susceptible commercial legume cultivar nga Giza 3 ubos sa mga kondisyon sa greenhouse. Ang mga kantidad nagrepresentar sa mean ± SD sa lima ka biological replicates (n = 5). Ang lain-laing mga letra nagpakita sa statistically significant nga mga kalainan tali sa mga pagtambal (p < 0.05). (F–H) Ang tipikal nga mga sintomas sa puti nga agup-op nagpakita sa mga punoan ug siliques sa ibabaw sa yuta, matag usa, 10 ka adlaw human sa inoculation sa isolate #3 (dpi). (I) Ang ebolusyonaryong pag-analisar sa internal transcribed spacer (ITS) nga rehiyon sa S. sclerotiorum isolate #3 gihimo gamit ang maximum likelihood method ug gitandi sa 20 ka reference isolates/strains nga nakuha gikan sa National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ang mga numero sa ibabaw sa clustering lines nagpakita sa rehiyon nga nasakup (%), ug ang mga numero sa ubos sa clustering lines nagpakita sa gitas-on sa sanga.
Dugang pa, aron kumpirmahon ang pathogenicity, upat ka nakuha nga S. sclerotiorum isolates ang gigamit aron i-inoculate ang susceptible commercial bean cultivar nga Giza 3 ubos sa greenhouse conditions, nga nahiuyon sa Koch's postulates (Fig. 1E). Bisan tuod ang tanang nakuha nga fungal isolates kay pathogenic ug mahimong maka-infect sa green bean (cv. Giza 3), nga hinungdan sa tipikal nga white mold symptoms sa tanang above-ground parts (Fig. 1F), ilabina sa mga stems (Fig. 1G) ug pods (Fig. 1H) sa 10 ka adlaw human sa inoculation (dpi), ang isolate 3 mao ang pinaka-agresibo nga isolate sa duha ka independent experiments. Ang Isolate 3 ang adunay pinakataas nga kagrabe sa sakit (%) sa mga tanom nga bean (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, ug 76.7 ± 3.1 sa 7, 14, ug 21 ka adlaw human sa impeksyon, matag usa; Figure 1F).
Ang pag-ila sa labing invasive nga S. sclerotiorum isolate #3 dugang nga gikumpirma base sa internal transcribed spacer (ITS) sequencing (Fig. 1I). Ang phylogenetic analysis tali sa isolate #3 ug 20 reference isolates/strains nagpakita og taas nga pagkaparehas (>99%) tali kanila. Angayan nga matikdan nga ang S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) adunay taas nga pagkaparehas sa American S. sclerotiorum isolate LPM36 nga nahimulag gikan sa uga nga mga liso sa gisantes (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) ug sa Chinese S. sclerotiorum isolate YKY211 (GenBank accession number OR206374.1; 548 bp), nga hinungdan sa violet (Matthiola incana) stem rot, nga ang tanan gigrupo nga gilain sa ibabaw sa dendrogram (Figure 1I). Ang bag-ong han-ay gideposito na sa NCBI database ug ginganlan og “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792). Makita nga ang isolate 3 mao ang labing invasive nga isolate; busa, kini nga isolate gipili alang sa pagtuon sa tanan nga sunod nga mga eksperimento.
Ang antibacterial nga kalihokan sa diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) sa lain-laing konsentrasyon (12.5, 25, 50, 75, 100 ug 125 mg/L) batok sa S. sclerotiorum isolate 3 gisusi in vitro. Matikdan nga ang L-ornithine adunay antibacterial nga epekto ug hinay-hinay nga nagpugong sa radial nga pagtubo sa S. sclerotiorum hyphae sa usa ka dose-dependent nga paagi (Figure 2A, B). Sa pinakataas nga konsentrasyon nga gisulayan (125 mg/L), ang L-ornithine nagpakita sa pinakataas nga mycelial growth inhibition rate (99.62 ± 0.27%; Figure 2B), nga katumbas sa komersyal nga fungicide nga Rizolex-T (inhibition rate 99.45 ± 0.39%; Figure 2C) sa pinakataas nga konsentrasyon nga gisulayan (10 mg/L), nga nagpakita sa parehas nga kaepektibo.
Hulagway 2. In vitro antibacterial nga kalihokan sa L-ornithine batok sa Sclerotinia sclerotiorum. (A) Pagtandi sa antibacterial nga kalihokan sa lain-laing konsentrasyon sa L-ornithine batok sa S. sclerotiorum gamit ang komersyal nga fungicide nga Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Rate sa pagpugong (%) sa pagtubo sa mycelial sa S. sclerotiorum human sa pagtambal gamit ang lain-laing konsentrasyon sa L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 ug 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ug 10 mg/L), matag usa. Ang mga kantidad nagrepresentar sa mean ± SD sa lima ka biological replicates (n = 5). Ang lain-laing mga letra nagpakita sa mga kalainan sa estadistika tali sa mga pagtambal (p < 0.05). (D, E) Probit model regression analysis sa L-ornithine ug komersyal nga fungicide nga Rizolex-T, matag usa. Ang linya sa regresyon sa probit model gipakita isip usa ka solidong asul nga linya, ug ang confidence interval (95%) gipakita isip usa ka putol-putol nga pula nga linya.
Dugang pa, gihimo ang probit regression analysis ug ang katugbang nga mga plot gipakita sa Table 1 ug Figures 2D,E. Sa laktod nga pagkasulti, ang madawat nga slope value (y = 2.92x − 4.67) ug ang kaubang significant statistics (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ug p < 0.0001; Figure 2D) sa L-ornithine nagpakita og mas kusog nga antifungal activity batok sa S. sclerotiorum kon itandi sa commercial fungicide nga Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ug p < 0.0001) (Table 1).
Talaan 1. Mga kantidad sa katunga sa labing taas nga konsentrasyon sa pagpugong (IC50) ug IC99 (mg/l) sa L-ornithine ug komersyal nga fungicide nga "Rizolex-T" batok sa S. sclerotiorum.
Sa kinatibuk-an, ang L-ornithine (250 mg/L) mikunhod pag-ayo sa pag-uswag ug kagrabe sa puti nga agup-op sa gitambalan nga mga tanom nga komon nga bean kon itandi sa wala matambali nga mga tanom nga nataptan sa S. sclerotiorum (kontrol; Figure 3A). Sa laktod nga pagkasulti, bisan tuod ang kagrabe sa sakit sa wala matambali nga nataptan nga mga tanom nga kontrol hinay-hinay nga misaka (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ug 92.33 ± 3.06%), ang L-ornithine mikunhod pag-ayo sa kagrabe sa sakit (%) sa tibuok eksperimento (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ug 26.36 ± 3.07) sa 7, 14, ug 21 ka adlaw human sa pagtambal (dpt), matag usa (Figure 3A). Susama, sa dihang ang mga tanom nga bean nga nataptan sa S. sclerotiorum gitambalan og 250 mg/L L-ornithine, ang area under the disease progression curve (AUDPC) mikunhod gikan sa 1274.33 ± 33.13 sa wala matambali nga kontrol ngadto sa 281.03 ± 7.95, nga gamay nga mas ubos kaysa sa positibo nga kontrol nga 50 mg/L Rizolex-T fungicide (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). Ang parehas nga trend naobserbahan sa ikaduhang eksperimento.
Hulagway 3. Epekto sa exogenous nga aplikasyon sa L-ornithine sa paglambo sa white rot sa common bean nga gipahinabo sa Sclerotinia sclerotiorum ubos sa mga kondisyon sa greenhouse. (A) Kurba sa pag-uswag sa sakit sa white mold sa common bean human sa pagtambal gamit ang 250 mg/L L-ornithine. (B) Kurba sa pag-uswag sa area ubos sa disease (AUDPC) sa white mold sa common bean human sa pagtambal gamit ang L-ornithine. Ang mga kantidad nagrepresentar sa mean ± SD sa lima ka biological replicates (n = 5). Ang lain-laing mga letra nagpakita sa statistically significant nga mga kalainan tali sa mga pagtambal (p < 0.05).
Ang exogenous nga aplikasyon sa 250 mg/L nga L-ornithine hinayhinay nga nagdugang sa gitas-on sa tanom (Fig. 4A), gidaghanon sa mga sanga matag tanom (Fig. 4B), ug gidaghanon sa mga dahon matag tanom (Fig. 4C) human sa 42 ka adlaw. Samtang ang komersyal nga fungicide nga Rizolex-T (50 mg/L) adunay pinakadako nga epekto sa tanang nutritional parameters nga gitun-an, ang exogenous nga aplikasyon sa 250 mg/L nga L-ornithine adunay ikaduha nga pinakadako nga epekto kon itandi sa wala matambali nga mga kontrol (Figs. 4A–C). Sa laing bahin, ang pagtambal sa L-ornithine walay dakong epekto sa sulod sa photosynthetic pigments nga chlorophyll a (Fig. 4D) ug chlorophyll b (Fig. 4E), apan gamay nga nagdugang sa kinatibuk-ang sulod sa carotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) kon itandi sa negatibo nga kontrol (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) ug positibo nga kontrol (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagpakita nga ang L-ornithine dili phytotoxic sa gitambalan nga mga legume ug mahimo pa gani nga makapadasig sa ilang pagtubo.
Hulagway 4. Epekto sa exogenous nga aplikasyon sa L-ornithine sa mga kinaiya sa pagtubo ug mga photosynthetic pigment sa mga dahon sa bean nga nataptan sa Sclerotinia sclerotiorum ubos sa mga kondisyon sa greenhouse. (A) Gitas-on sa tanom (cm), (B) Gidaghanon sa mga sanga kada tanom, (C) Gidaghanon sa mga dahon kada tanom, (D) Sulod sa chlorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) Sulod sa chlorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) Kinatibuk-ang sulod sa carotenoid (mg g-1 fr wt). Ang mga kantidad mao ang mean ± SD sa lima ka biological replicates (n = 5). Ang lain-laing mga letra nagpakita sa istatistikal nga mahinungdanong mga kalainan tali sa mga pagtambal (p < 0.05).
Ang in situ histochemical localization sa reactive oxygen species (ROS; gipahayag isip hydrogen peroxide [H2O2]) ug free radicals (gipahayag isip superoxide anions [O2•−]) nagpadayag nga ang exogenous application sa L-ornithine (250 mg/L) mikunhod pag-ayo sa akumulasyon sa H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) ug O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) kon itandi sa akumulasyon sa wala matambali nga nataptan nga mga tanom (173.31 ± 12.06 ug 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, matag usa) ug mga tanom nga gitambalan og 50 mg/L sa komersyal nga fungicide nga Rizolex-T (170.12 ± 9.50 ug 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, matag usa) sa 72 ka oras. Taas nga lebel sa H2O2 ug O2•− ang natipon ubos sa hpt (Fig. 5A, B). Sa susama, ang TCA-based malondialdehyde (MDA) assay nagpakita nga ang mga tanom nga bean nga nataptan sa S. sclerotiorum nakatipon og mas taas nga lebel sa MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) sa ilang mga dahon (Fig. 5C). Bisan pa, ang exogenous nga aplikasyon sa L-ornithine mikunhod pag-ayo sa lipid peroxidation sama sa gipamatud-an sa pagkunhod sa sulud sa MDA sa mga gitambalan nga tanom (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Hulagway 5. Epekto sa exogenous nga aplikasyon sa L-ornithine sa mga nag-unang marker sa oxidative stress ug non-enzymatic antioxidant defense mechanisms sa mga dahon sa bean nga nataptan sa S. sclerotiorum sa 72 ka oras human sa impeksyon ubos sa mga kondisyon sa greenhouse. (A) Hydrogen peroxide (H2O2; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (B) superoxide anion (O2•−; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (D) total soluble phenols (mg GAE g−1 FW) sa 72 hpt, (E) total soluble flavonoids (mg RE g−1 FW) sa 72 hpt, (F) total free amino acids (mg g−1 FW) sa 72 hpt, ug (G) proline content (mg g−1 FW) sa 72 hpt. Ang mga kantidad nagrepresentar sa mean ± standard deviation (mean ± SD) sa 5 ka biological replicates (n = 5). Ang lain-laing mga letra nagpakita sa statistically significant nga mga kalainan tali sa mga pagtambal (p < 0.05).