Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta para sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Ang mga insulin nanoparticle (NP) nga adunay taas nga loading content nakakaplag ug lain-laing mga aplikasyon sa lain-laing mga porma sa dosis. Kini nga trabaho nagtumong sa pagtimbang-timbang sa epekto sa mga proseso sa freeze-drying ug spray-drying sa istruktura sa mga insulin-loaded chitosan nanoparticle, nga adunay o walay mannitol isip cryoprotectant. Gisusi usab namo ang kalidad niining mga nanoparticle pinaagi sa pag-redissolve niini. Sa wala pa ang dehydration, ang gidak-on sa partikulo sa chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked nanoparticles gi-optimize nga 318 nm, ang PDI kay 0.18, ang encapsulation efficiency kay 99.4%, ug ang loading kay 25.01%. Human sa reconstitution, ang tanang nanoparticles, gawas niadtong gihimo pinaagi sa freeze-drying method nga walay paggamit og mannitol, nagpabilin sa ilang spherical particle structure. Kon itandi sa mga mannitol-containing nanoparticles nga gi-dehydrate sa bisan hain nga spray, ang mannitol-free spray-dried nanoparticles nagpakita usab sa pinakagamay nga mean particle size (376 nm) ug ang pinakataas nga loading content. (25.02%) nga adunay parehas nga encapsulation rate (98.7%) ug PDI (0.20) pinaagi sa mga teknik sa pagpauga o freeze-drying. Ang gipauga nga mga nanoparticle pinaagi sa spray drying nga walay mannitol miresulta usab sa pinakapaspas nga pagpagawas sa insulin ug sa pinakataas nga efficiency sa cellular uptake. Kini nga trabaho nagpakita nga ang spray drying maka-dehydrate sa mga insulin nanoparticle nga dili kinahanglan og cryoprotectants kon itandi sa naandan nga mga pamaagi sa freeze drying, nga nagmugna og mas dako nga loading capacity, mas ubos nga additive requirements ug operating costs nga adunay dakong bentaha.
Sukad sa pagkadiskobre niini niadtong 19221,2,3, ang insulin ug ang mga pagpangandam niini sa parmasyutiko nakaluwas sa kinabuhi sa mga pasyente nga adunay type 1 diabetes (T1DM) ug type 2 diabetes (T1DM). Bisan pa, tungod sa mga kabtangan niini isip usa ka taas nga molecular weight protein, ang insulin dali nga matipon, mabungkag sa mga proteolytic enzyme, ug matangtang pinaagi sa first-pass effect. Ang mga tawo nga nadayagnos nga adunay type 1 diabetes nanginahanglan og mga injection sa insulin sa tibuok nilang kinabuhi. Daghang mga pasyente nga unang nadayagnos nga adunay type 2 diabetes nanginahanglan usab og dugay nga mga injection sa insulin. Ang adlaw-adlaw nga mga injection sa insulin usa ka seryoso nga tinubdan sa adlaw-adlaw nga kasakit ug kahasol alang niining mga indibidwal, nga adunay negatibo nga mga epekto sa kahimsog sa pangisip. Ingon usa ka sangputanan, ang ubang mga porma sa administrasyon sa insulin nga hinungdan sa dili kaayo kahasol, sama sa oral nga administrasyon sa insulin, gitun-an pag-ayo5 tungod kay kini adunay potensyal nga ibalik ang kalidad sa kinabuhi sa gibana-bana nga 5 bilyon nga mga tawo nga adunay diabetes sa tibuuk kalibutan.
Ang teknolohiya sa nanoparticle nakahatag ug dakong pag-uswag sa mga pagsulay sa pagkuha sa oral nga insulin4,6,7. Usa nga epektibong nag-encapsulate ug nanalipod sa insulin gikan sa pagkadaot alang sa gitarget nga paghatud sa piho nga mga lugar sa lawas. Bisan pa, ang paggamit sa mga pormulasyon sa nanoparticle adunay daghang mga limitasyon, labi na tungod sa mga isyu sa kalig-on sa mga suspensyon sa partikulo. Ang pipila ka aggregation mahimong mahitabo sa panahon sa pagtipig, nga nagpamenos sa bioavailability sa mga nanoparticle nga puno sa insulin8. Dugang pa, ang kemikal nga kalig-on sa polymer matrix sa mga nanoparticle ug insulin kinahanglan usab nga tagdon aron masiguro ang kalig-on sa mga nanoparticle sa insulin (NP). Sa pagkakaron, ang teknolohiya sa freeze-drying mao ang gold standard alang sa paghimo og lig-on nga mga NP samtang gipugngan ang dili gusto nga mga pagbag-o sa panahon sa pagtipig9.
Apan, ang freeze-drying nagkinahanglan og pagdugang og cryoprotectants aron mapugngan ang spherical structure sa NPs nga maapektuhan sa mechanical stress sa ice crystals. Kini makapakunhod pag-ayo sa loading sa insulin nanoparticles human sa lyophilization, tungod kay ang cryoprotectant nag-okupar sa kadaghanan sa weight ratio. Busa, ang gihimo nga insulin NPs kasagarang makita nga dili angay alang sa paghimo og dry powder formulations, sama sa oral tablets ug oral films, tungod sa panginahanglan alang sa daghang dry nanoparticles aron makab-ot ang therapeutic window sa insulin.
Ang spray drying usa ka ilado ug barato nga proseso sa industriya alang sa paghimo og mga uga nga pulbos gikan sa mga likido nga hugna sa industriya sa parmasyutiko10,11. Ang pagkontrol sa proseso sa pagporma sa partikulo nagtugot sa husto nga pag-encapsulate sa daghang mga bioactive compound12, 13. Dugang pa, kini nahimong usa ka epektibo nga teknik alang sa pag-andam sa mga encapsulated nga protina alang sa oral nga administrasyon. Atol sa spray drying, ang tubig dali nga moalisngaw, nga makatabang sa pagpabilin nga ubos ang temperatura sa particle core11,14, nga nagtugot sa aplikasyon niini sa pag-encapsulate sa mga sangkap nga sensitibo sa kainit. Sa dili pa ang spray drying, ang materyal sa coating kinahanglan nga hingpit nga homogenized sa solusyon nga adunay sulud nga mga encapsulated nga sangkap11,14. Dili sama sa freeze-drying, ang homogenization sa dili pa ang encapsulation sa spray-drying nagpauswag sa kahusayan sa encapsulation sa panahon sa dehydration. Tungod kay ang proseso sa spray-drying encapsulation wala magkinahanglan og cryoprotectants, ang spray-drying mahimong magamit aron makahimo og mga uga nga NP nga adunay taas nga loading content.
Kini nga pagtuon nagtaho sa produksiyon sa mga NP nga puno sa insulin pinaagi sa cross-linking sa chitosan ug sodium tripolyphosphate gamit ang ion gel method. Ang ion gelation usa ka pamaagi sa pag-andam nga nagtugot sa produksiyon sa mga nanoparticle pinaagi sa electrostatic interactions tali sa duha o daghan pang ionic species ubos sa pipila ka mga kondisyon. Ang mga teknik sa freeze-drying ug spray-drying gigamit aron ma-dehydrate ang na-optimize nga chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked nanoparticles. Human sa dehydration, ang ilang morphology gi-analisa pinaagi sa SEM. Ang ilang abilidad sa recombination gisusi pinaagi sa pagsukod sa ilang size distribution, surface charge, PDI, encapsulation efficiency, ug loading content. Ang kalidad sa resolubilized nanoparticles nga gihimo sa lain-laing mga pamaagi sa dehydration gisusi usab pinaagi sa pagtandi sa ilang insulin protection, release behavior, ug cellular uptake efficacy.
Ang pH sa gisagol nga solusyon ug ang ratio sa chitosan ug insulin duha ka importanteng butang nga makaapekto sa gidak-on sa partikulo ug encapsulation efficiency (EE) sa katapusang NPs, tungod kay kini direktang makaapekto sa proseso sa ionotropic gelation. Ang pH sa gisagol nga solusyon gipakita nga adunay dakong kalambigitan sa gidak-on sa partikulo ug encapsulation efficiency (Fig. 1a). Sama sa gipakita sa Fig. 1a, samtang ang pH misaka gikan sa 4.0 ngadto sa 6.0, ang average nga gidak-on sa partikulo (nm) mikunhod ug ang EE misaka pag-ayo, samtang sa dihang ang pH misaka ngadto sa 6.5, ang average nga gidak-on sa partikulo nagsugod sa pagtaas ug ang EE nagpabilin nga wala mausab. Samtang ang ratio sa chitosan ngadto sa insulin misaka, ang average nga gidak-on sa partikulo misaka usab. Dugang pa, walay pagbag-o sa EE nga naobserbahan sa dihang ang mga nanoparticle giandam sa mass ratio sa chitosan/insulin nga mas taas kay sa 2.5:1 (w/w) (Fig. 1b). Busa, ang labing maayo nga mga kondisyon sa pagpangandam niini nga pagtuon (pH 6.0, chitosan/insulin mass ratio nga 2.5:1) gigamit aron pag-andam og mga nanoparticle nga puno sa insulin para sa dugang nga pagtuon. Ubos niini nga kondisyon sa pagpangandam, ang aberids nga gidak-on sa partikulo sa mga nanoparticle sa insulin gi-optimize nga 318 nm (Fig. 1c), ang PDI kay 0.18, ang embedding efficiency kay 99.4%, ang zeta potential kay 9.8 mv, ug ang insulin loading kay 25.01% (m/m). Base sa mga resulta sa transmission electron microscopy (TEM), ang gi-optimize nga mga nanoparticle halos spherical ug discrete nga adunay medyo parehas nga gidak-on (Fig. 1d).
Pag-optimize sa mga parameter sa mga nanoparticle sa insulin: (a) ang epekto sa pH sa mean diameter ug encapsulation efficiency (EE) sa mga nanoparticle sa insulin (giandam sa 5:1 mass ratio sa chitosan ug insulin); (b) chitosan ug Impluwensya sa mass ratio sa insulin sa mean diameter ug encapsulation efficiency (EE) sa mga insulin NP (giandam sa pH 6); (c) distribusyon sa gidak-on sa partikulo sa gi-optimize nga mga nanoparticle sa insulin; (d) TEM micrograph sa gi-optimize nga mga NP sa insulin.
Nailhan pag-ayo nga ang chitosan usa ka huyang nga polyelectrolyte nga adunay pKa nga 6.5. Kini positibo nga nakarga sa acidic media tungod kay ang panguna nga amino group niini giprotonated sa mga hydrogen ion15. Busa, kini kanunay nga gigamit ingon usa ka carrier aron ma-encapsulate ang mga negatively charged macromolecules. Niini nga pagtuon, ang chitosan gigamit aron ma-encapsulate ang insulin nga adunay isoelectric point nga 5.3. Tungod kay ang chitosan gigamit ingon usa ka materyal sa coating, uban ang pagtaas sa proporsyon niini, ang gibag-on sa gawas nga layer sa mga nanoparticle nagdugang usab, nga miresulta sa usa ka mas dako nga average nga gidak-on sa partikulo. Dugang pa, ang mas taas nga lebel sa chitosan mahimong maka-encapsulate og dugang nga insulin. Sa among kaso, ang EE labing taas kung ang ratio sa chitosan ug insulin nakaabot sa 2.5:1, ug wala’y hinungdanon nga pagbag-o sa EE kung ang ratio nagpadayon sa pagtaas.
Gawas sa ratio sa chitosan ug insulin, ang pH adunay usab hinungdanon nga papel sa pag-andam sa mga NP. Gitun-an ni Gan et al. 17 ang epekto sa pH sa gidak-on sa partikulo sa mga nanoparticle sa chitosan. Nakakita sila og padayon nga pagkunhod sa gidak-on sa partikulo hangtod nga ang pH nakaabot sa 6.0, ug usa ka hinungdanon nga pagtaas sa gidak-on sa partikulo ang naobserbahan sa pH > 6.0, nga nahiuyon sa among mga obserbasyon. Kini nga panghitabo tungod sa kamatuoran nga sa pagtaas sa pH, ang molekula sa insulin nakakuha og negatibo nga karga sa nawong, busa, pabor sa electrostatic interaction sa chitosan/sodium tripolyphosphate (TPP) complex, nga miresulta sa gamay nga gidak-on sa partikulo ug taas nga EE. Bisan pa, sa dihang ang pH gi-adjust sa 6.5, ang mga amino group sa chitosan na-deprotonate, nga miresulta sa chitosan folding. Busa, ang taas nga pH moresulta sa gamay nga pagkaladlad sa mga amino ion sa TPP ug insulin, nga miresulta sa mas ubos nga cross-linking, mas dako nga katapusang average nga gidak-on sa partikulo ug mas ubos nga EE.
Ang pag-analisar sa mga morphological properties sa freeze-dried ug spray-dried NPs makagiya sa pagpili sa mas maayong dehydration ug powder formation techniques. Ang gipalabi nga pamaagi kinahanglan maghatag og drug stability, uniporme nga particle shape, taas nga drug loading ug maayong solubility sa orihinal nga solusyon. Niini nga pagtuon, aron mas maayo nga itandi ang duha ka teknik, ang insulin NPs nga adunay o walay 1% mannitol gigamit atol sa dehydration. Ang mannitol gigamit isip bulking agent o cryoprotectant sa lain-laing dry powder formulations para sa freeze drying ug spray drying. Para sa lyophilized insulin nanoparticles nga walay mannitol, sama sa gipakita sa Figure 2a, usa ka highly porous powder structure nga adunay dagko, dili regular ug bagis nga mga nawong ang naobserbahan ubos sa scanning electron microscopy (SEM). Pipila ka discrete particles ang nakita sa powder human sa dehydration (Fig. 2e). Kini nga mga resulta nagpakita nga kadaghanan sa mga NP nadugta atol sa freeze-drying nga walay bisan unsang cryoprotectant. Para sa freeze-dried ug spray-dried insulin nanoparticles nga adunay 1% mannitol, ang spherical nanoparticles nga adunay hamis nga mga nawong ang naobserbahan (Fig. 2). 2b,d,f,h). Ang mga nanoparticle sa insulin nga gi-spray-dried nga walay mannitol nagpabilin nga lingin apan kunot sa ibabaw (Fig. 2c). Ang lingin ug kunot nga mga nawong dugang nga gihisgutan sa release behavior ug cellular uptake tests sa ubos. Base sa makita nga panagway sa mga uga nga NP, ang parehong spray-dried nga NP nga walay mannitol ug NP nga gi-freeze-dried ug gi-spray-dried gamit ang mannitol nakahatag og pino nga mga pulbos sa NP (Fig. 2f,g,h). Kon mas dako ang surface area taliwala sa mga particle surface, mas taas ang solubility ug busa mas taas ang release rate.
Morpolohiya sa lain-laing dehydrated insulin NPs: (a) SEM nga hulagway sa lyophilized insulin NPs nga walay mannitol; (b) SEM nga hulagway sa lyophilized insulin NPs nga adunay mannitol; (c) spray-dried insulin NPs nga walay mannitol SEM nga hulagway sa ; (d) SEM nga hulagway sa insulin NPs nga spray-dried gamit ang mannitol; (e) hulagway sa lyophilized insulin NPs nga pulbos nga walay mannitol; (f) hulagway sa lyophilized insulin NPs nga adunay mannitol; (g) Hulagway sa spray-dried insulin NPs nga pulbos nga walay mannitol; (h) hulagway sa spray-dried insulin NPs nga pulbos nga adunay mannitol.
Atol sa freeze-drying, ang mannitol molihok isip cryoprotectant, nga magpabilin sa mga NP sa amorphous nga porma ug makapugong sa kadaot sa mga kristal sa yelo19. Sa kasukwahi, walay freezing step atol sa spray drying. Busa, ang mannitol dili kinahanglan niini nga pamaagi. Sa tinuud, ang spray-dried NPs nga walay mannitol nakahatag og mas pino nga NPs sama sa gihulagway kaniadto. Bisan pa, ang mannitol mahimo gihapon nga molihok isip filler sa proseso sa spray-drying aron mahatagan ang mga NP og mas spherical nga istruktura20 (Fig. 2d), nga makatabang sa pagkuha og parehas nga release behavior sa maong encapsulated NPs. Dugang pa, klaro nga ang pipila ka dagkong mga partikulo mahimong makit-an sa parehong freeze-dried ug spray-dried insulin NPs nga adunay mannitol (Fig. 2b,d), nga mahimong tungod sa akumulasyon sa mannitol sa particle core uban sa encapsulated insulin. Ngadto sa. Lapis sa Chitosan. Angayan nga matikdan nga niini nga pagtuon, aron masiguro nga ang lingin nga istruktura magpabilin nga wala madaot human sa dehydration, ang ratio sa mannitol ug chitosan gipadayon sa 5:1, aron ang daghang gidaghanon sa filler makapadako usab sa gidak-on sa partikulo sa mga uga nga NP.
Ang Fourier transform infrared attenuated total reflection (FTIR-ATR) spectroscopy nagpakita sa pisikal nga sagol sa libre nga insulin, chitosan, chitosan, TPP ug insulin. Ang tanan nga dehydrated NPs gihulagway pinaagi sa paggamit sa FTIR-ATR spectroscopy. Ilabi na, ang band intensities nga 1641, 1543 ug 1412 cm-1 naobserbahan sa encapsulated NPs nga freeze-dried gamit ang mannitol ug sa NPs nga spray-dried gamit ug walay mannitol (Fig. 3). Sama sa gitaho kaniadto, kini nga mga pagtaas sa kusog nalangkit sa cross-linking tali sa chitosan, TPP ug insulin. Ang imbestigasyon sa interaksyon tali sa chitosan ug insulin nagpakita nga sa FTIR spectra sa insulin-loaded chitosan nanoparticles, ang chitosan band nag-overlap sa insulin, nga nagdugang sa carbonyl intensity (1641 cm-1) ug amine (1543 cm-1) belt. Ang tripolyphosphate groups sa TPP nalambigit sa ammonium groups sa chitosan, nga nagporma og band. sa 1412 cm-1.
FTIR-ATR spectra sa libreng insulin, chitosan, pisikal nga sagol sa chitosan/TPP/insulin ug NPs nga gi-dehydrate pinaagi sa lain-laing mga pamaagi.
Dugang pa, kini nga mga resulta nahiuyon sa gipakita sa SEM, nga nagpakita nga ang mga encapsulated NP nagpabilin nga wala madaot kung gi-spray ug gi-freeze-dried gamit ang mannitol, apan kung wala ang mannitol, ang spray-drying lamang ang nakamugna og mga encapsulated particle. Sa kasukwahi, ang mga resulta sa FTIR-ATR spectral sa mga NP nga gi-freeze-dried nga walay mannitol susama kaayo sa pisikal nga sagol sa chitosan, TPP, ug insulin. Kini nga resulta nagpakita nga ang mga cross-link tali sa chitosan, TPP ug insulin wala na sa mga NP nga gi-freeze-dried nga walay mannitol. Ang istruktura sa NP naguba atol sa freeze-drying nga walay cryoprotectant, nga makita sa mga resulta sa SEM (Fig. 2a). Base sa morphology ug mga resulta sa FTIR sa mga dehydrated insulin NP, ang mga lyophilized, spray-dried, ug mannitol-free NP lamang ang gigamit alang sa mga eksperimento sa reconstitution ug mannitol-free NP tungod sa pagkadunot sa mannitol-free NP atol sa dehydration. Hisguti.
Ang dehydration gigamit alang sa dugay nga pagtipig ug pagproseso pag-usab ngadto sa ubang mga pormulasyon. Ang abilidad sa uga nga mga NP sa pag-reconstitute human sa pagtipig hinungdanon alang sa ilang paggamit sa lain-laing mga pormulasyon sama sa mga tablet ug mga pelikula. Among namatikdan nga ang aberids nga gidak-on sa partikulo sa spray-dried insulin NPs nga walay mannitol misaka lamang og gamay human sa pag-reconstitution. Sa laing bahin, ang gidak-on sa partikulo sa spray-dried ug freeze-dried insulin nanoparticles nga adunay mannitol misaka pag-ayo (Talaan 1). Ang PDI ug EE wala kaayo mausab (p > 0.05) human sa recombination sa tanang NPs niini nga pagtuon (Talaan 1). Kini nga resulta nagpakita nga kadaghanan sa mga partikulo nagpabilin nga wala mausab human sa pag-redissolve. Bisan pa, ang pagdugang sa mannitol miresulta sa dakong pagkunhod sa insulin loading sa lyophilized ug spray-dried mannitol nanoparticles (Talaan 1). Sa kasukwahi, ang insulin load content sa NPs nga spray-dried nga walay mannitol nagpabilin nga parehas sa kaniadto (Talaan 1).
Nailhan pag-ayo nga ang pagkarga sa mga nanoparticle kritikal kung gamiton alang sa mga katuyoan sa paghatud sa tambal. Alang sa mga NP nga adunay ubos nga pagkarga, daghang kantidad sa materyal ang gikinahanglan aron maabot ang therapeutic threshold. Bisan pa, ang taas nga viscosity sa ingon nga taas nga konsentrasyon sa NP nagdala sa kahasol ug kalisud sa oral nga administrasyon ug injectable nga mga pormulasyon, matag usa 22. Dugang pa, ang mga insulin NP mahimo usab nga gamiton sa paghimo og mga tablet ug viscous biofilms 23, 24, nga nanginahanglan sa paggamit sa daghang kantidad sa NP sa ubos nga lebel sa pagkarga, nga moresulta sa dagkong mga tablet ug baga nga biofilms nga dili angay alang sa oral nga aplikasyon. Busa, ang mga dehydrated NP nga adunay taas nga insulin load gitinguha kaayo. Ang among mga resulta nagsugyot nga ang taas nga insulin load sa mannitol-free spray-dried NPs mahimong magtanyag daghang madanihon nga mga bentaha alang niining alternatibong mga pamaagi sa paghatud.
Ang tanang dehydrated NPs gibutang sa refrigerator sulod sa tulo ka bulan. Ang mga resulta sa SEM nagpakita nga ang morphology sa tanang dehydrated NPs wala kaayo mausab atol sa tulo ka bulan nga pagtipig (Fig. 4). Human sa pagsagol sa tubig, ang tanang NPs nagpakita og gamay nga pagkunhod sa EE ug nagpagawas og halos gamay nga kantidad (~5%) sa insulin atol sa tulo ka bulan nga panahon sa pagtipig (Table 2). Bisan pa, ang aberids nga gidak-on sa partikulo sa tanang nanoparticles misaka. Ang gidak-on sa partikulo sa mga NP nga gi-spray-dried nga walay mannitol misaka ngadto sa 525 nm, samtang ang sa spray-dried ug freeze-dried NPs nga adunay mannitol misaka ngadto sa 872 ug 921 nm, matag usa (Table 2).
Morpolohiya sa lain-laing dehydrated insulin NPs nga gitipigan sulod sa tulo ka bulan: (a) SEM nga hulagway sa lyophilized insulin NPs nga adunay mannitol; (b) SEM nga hulagway sa spray-dried insulin nanoparticles nga walay mannitol; (c) walay mannitol SEM nga mga hulagway sa spray-dried insulin NPs.
Dugang pa, nakita ang mga precipitate sa gi-reconstitute nga insulin nanoparticles nga gi-spray-dried gamit ang mannitol ug gi-freeze-dried (Fig. S2). Mahimo kini nga hinungdan sa dagkong mga partikulo nga wala mag-suspende sa tubig. Ang tanan nga mga resulta sa ibabaw nagpakita nga ang spray drying technique makaprotekta sa mga insulin nanoparticles gikan sa dehydration ug nga ang daghang insulin nanoparticles makuha nga wala’y bisan unsang fillers o cryoprotectants.
Ang pagpabilin sa insulin gisulayan sa pH = 2.5 nga medium gamit ang pepsin, trypsin, ug α-chymotrypsin aron ipakita ang abilidad sa pagpanalipod sa mga NP batok sa enzymatic digestion pagkahuman sa dehydration. Ang pagpabilin sa insulin sa mga dehydrated NP gitandi sa bag-ong giandam nga mga NP, ug ang libre nga insulin gigamit isip negatibo nga kontrol. Niini nga pagtuon, ang libre nga insulin nagpakita og paspas nga pagtangtang sa insulin sulod sa 4 ka oras sa tanang tulo ka enzymatic treatment (Fig. 5a–c). Sa kasukwahi, ang pagsulay sa pagtangtang sa insulin sa mga NP nga gi-freeze-dried gamit ang mannitol ug ang mga NP nga gi-spray-dried nga adunay o walay mannitol nagpakita og mas taas nga proteksyon niining mga NP batok sa enzymatic digestion, nga susama sa bag-ong giandam nga insulin NP (figure 1).5a-c). Uban sa tabang sa mga nanoparticle sa pepsin, trypsin, ug α-chymotrypsin, labaw sa 50%, 60%, ug 75% sa insulin ang mapanalipdan sulod sa 4 ka oras, matag usa (Fig. 5a–c). Kini nga abilidad sa pagpanalipod sa insulin mahimong nagdugang sa tsansa sa mas taas nga pagsuhop sa insulin ngadto sa agos sa dugo25. Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang spray drying nga adunay o walay mannitol ug freeze-drying nga adunay mannitol makapreserbar sa abilidad sa mga NP sa pagpanalipod sa insulin human sa dehydration.
Panalipod ug kinaiya sa pagpagawas sa mga dehydrated insulin NP: (a) pagpanalipod sa insulin sa pepsin solution; (b) pagpanalipod sa insulin sa trypsin solution; (c) pagpanalipod sa insulin pinaagi sa α-chymotrypsin solution; (d) Ang kinaiya sa pagpagawas sa mga dehydrated NP sa pH = 2.5 nga solusyon; (e) ang kinaiya sa pagpagawas sa mga dehydrated NP sa pH = 6.6 nga solusyon; (f) ang kinaiya sa pagpagawas sa mga dehydrated NP sa pH = 7.0 nga solusyon.
Ang bag-ong giandam ug gi-reconstitute nga dry insulin NPs gi-incubate sa lain-laing buffers (pH = 2.5, 6.6, 7.0) sa 37 °C, nga gisundog ang pH environment sa tiyan, duodenum, ug ibabaw nga bahin sa gamay nga tinai, aron masusi ang epekto sa insulin sa insulin resistance. Kinaiya sa pagpagawas sa lain-laing mga palibot. Tipik sa gastrointestinal tract. Sa pH = 2.5, ang mga insulin-loaded NP ug resolubilized dry insulin NP nagpakita og inisyal nga pagbuto sulod sa unang usa ka oras, gisundan sa hinay nga pagpagawas sulod sa sunod nga 5 ka oras (Fig. 5d). Kini nga paspas nga pagpagawas sa sinugdanan lagmit resulta sa paspas nga pagkaguba sa nawong sa mga molekula sa protina nga wala hingpit nga na-immobilize sa internal nga istruktura sa partikulo. Sa pH = 6.5, ang mga insulin-loaded NP ug reconstituted dry insulin NP nagpakita og hapsay ug hinay nga pagpagawas sulod sa 6 ka oras, tungod kay ang pH sa test solution parehas sa NPs-prepared solution (Fig. 5e). Sa pH = 7, ang mga NP dili lig-on ug hapit hingpit nga nadugta sulod sa unang duha ka oras (Fig. 5f). Kini tungod kay ang deprotonation sa chitosan mahitabo sa mas taas nga pH, nga moresulta sa dili kaayo compact nga polymer network ug pagpagawas sa loaded insulin.
Dugang pa, ang mga insulin NP nga gi-spray-dried nga walay mannitol nagpakita og mas paspas nga release profile kay sa ubang dehydrated NPs (Fig. 5d–f). Sama sa gihulagway kaniadto, ang gi-reconstitute nga insulin NPs nga gi-dried nga walay mannitol nagpakita sa pinakagamay nga gidak-on sa partikulo. Ang gagmay nga mga partikulo naghatag og mas dako nga surface area, mao nga kadaghanan sa may kalabutan nga tambal anaa sa o duol sa nawong sa partikulo, nga moresulta sa paspas nga pagpagawas sa tambal26.
Ang cytotoxicity sa mga NP gisusi pinaagi sa MTT assay. Sama sa gipakita sa Figure S4, ang tanang dehydrated NPs nakit-an nga walay dakong epekto sa cell viability sa mga konsentrasyon nga 50–500 μg/ml, nga nagsugyot nga ang tanang dehydrated NPs luwas nga magamit aron makaabot sa therapeutic window.
Ang atay mao ang pangunang organo diin ang insulin naggamit sa mga gimbuhaton niini sa lawas. Ang mga selula sa HepG2 usa ka linya sa selula sa hepatoma sa tawo nga kasagarang gigamit isip in vitro hepatocyte uptake model. Dinhi, ang mga selula sa HepG2 gigamit aron masusi ang cellular uptake sa mga NP nga dehydrated gamit ang mga pamaagi sa freeze-drying ug spray-drying. Ang cellular uptake pinaagi sa confocal laser scanning gamit ang flow cytometry ug vision human sa pipila ka oras nga incubation gamit ang libre nga FITC insulin sa konsentrasyon nga 25 μg/mL, bag-ong giandam nga FITC insulin-loaded NPs ug dehydrated FITC insulin-loaded NPs sa parehas nga konsentrasyon sa insulin. Gihimo ang mga obserbasyon sa quantitative microscopy (CLSM). Ang mga Lyophilized NP nga walay mannitol naguba atol sa dehydration ug wala gisusi niini nga pagsulay. Ang intracellular fluorescence intensities sa bag-ong giandam nga insulin-loaded NPs, lyophilized NPs nga adunay mannitol, ug spray-dried NPs nga adunay ug walay mannitol (Fig. 6a) kay 4.3, 2.6, 2.4, ug 4.1-pilo nga mas taas kaysa ang mga libre. FITC-insulin group, matag usa (Fig. 6b). Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang encapsulated insulin mas kusog sa cellular uptake kaysa libre nga insulin, labi na tungod sa mas gamay nga gidak-on sa insulin-loaded nanoparticles nga gihimo sa pagtuon.
Pagsuyop sa selula sa HepG2 human sa 4 ka oras nga incubation uban sa bag-ong giandam nga mga NP ug dehydrated nga mga NP: (a) Pag-apod-apod sa pagsuyop sa FITC-insulin sa mga selula sa HepG2.(b) Geometric mean sa fluorescence intensities nga gisusi pinaagi sa flow cytometry (n = 3), *P < 0.05 kon itandi sa free insulin.
Ingon man usab, ang mga imahe sa CLSM nagpakita nga ang FITC fluorescence intensities sa bag-ong giandam nga FITC-insulin-loaded NPs ug FITC-insulin-loaded spray-dried NPs (walay mannitol) mas kusog kay sa ubang mga sample (Fig. 6a). Dugang pa, uban sa pagdugang sa mannitol, ang mas taas nga viscosity sa solusyon nagdugang sa resistensya sa cellular uptake, nga miresulta sa pagkunhod sa insulin proliferation. Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang mannitol-free spray-dried NPs nagpakita sa labing taas nga cellular uptake efficiency tungod kay ang ilang particle size mas gamay kay sa freeze-dried NPs human sa re-dissolution.
Ang Chitosan (average molecular weight 100 KDa, 75–85% deacetylated) gipalit gikan sa Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Canada). Ang sodium tripolyphosphate (TPP) gipalit gikan sa VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). Ang recombinant human insulin nga gigamit niini nga pagtuon gikan sa Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Ang Fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled human insulin ug 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) gipalit gikan sa Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Canada). Ang HepG2 cell line nakuha gikan sa ATCC (Manassas, Virginia, USA). Ang tanan nga ubang mga reagent kay analytical o chromatographic grade.
Pag-andam og 1 mg/ml nga solusyon sa CS pinaagi sa pagtunaw niini sa double distilled water (DD water) nga adunay 0.1% acetic acid. Pag-andam og 1 mg/ml nga solusyon sa TPP ug insulin pinaagi sa pagtunaw niini sa DD water ug 0.1% acetic acid, matag usa. Ang pre-emulsion giandam gamit ang polytron PCU-2-110 high speed homogenizer (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Ang proseso sa pag-andam mao ang mosunod: una, 2ml nga solusyon sa TPP ang idugang sa 4ml nga solusyon sa insulin, ug ang sagol gikutaw sulod sa 30 minutos ug hingpit nga gisagol. Dayon, ang gisagol nga solusyon gidugang nga tinulo ngadto sa solusyon sa CS pinaagi sa usa ka syringe ubos sa high-speed stirring (10,000 rpm). Ang mga sagol gipadayon ubos sa high-speed stirring (15,000 rpm) sa usa ka ice bath sulod sa 30 minutos, ug kini gi-adjust sa usa ka piho nga pH aron makakuha og cross-linked insulin NPs. Aron mas ma-homogenize ug makunhuran ang gidak-on sa partikulo sa insulin NPs, kini gi-sonicate sulod sa dugang nga 30 minutos sa ice bath gamit ang probe-type sonicator (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany).
Ang Insulin NPS gisulayan para sa Z-average diameter, polydispersity index (PDI) ug zeta potential gamit ang dynamic light scattering (DLS) measurements gamit ang Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) pinaagi sa pagtunaw niini sa DD water sa 25°C. Ang morpolohiya ug distribusyon sa gidak-on gi-characterize gamit ang Hitachi H7600 transmission electron microscope (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japan), ug ang mga imahe gi-analisa gamit ang Hitachi imaging software (Hitachi, Tokyo, Japan). Aron masusi ang encapsulation efficiency (EE) ug loading capacity (LC) sa insulin NPs, ang mga NP gi-pipette ngadto sa ultrafiltration tubes nga adunay molecular weight cut-off nga 100 kDa ug gi-centrifuge sa 500 xg sulod sa 30 minutos. Ang wala ma-encapsulate nga insulin sa filtrate gi-quantify gamit ang Agilent 1100 Series HPLC system (Agilent, Santa Clara, California, USA) nga gilangkoban sa quaternary pump, autosampler, column. heater, ug DAD detector. Ang insulin gisusi gamit ang C18 column (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) ug na-detect sa 214 nm. Ang mobile phase kay acetonitrile ug tubig, nga adunay 0.1% TFA, gradient ratios gikan sa 10/90 hangtod 100/0, ug gipadagan sulod sa 10 ka minuto. Ang mobile phase gibomba sa flow rate nga 1.0 ml/min. Ang temperatura sa column gibutang sa 20 °C. Kwentaha ang mga porsyento sa EE ug LC gamit ang mga equation.(1) ug Eq.(2).
Nagkalain-laing CS/insulin ratios gikan sa 2.0 ngadto sa 4.0 ang gisulayan aron ma-optimize ang insulin NP. Nagkalain-laing gidaghanon sa CS solution ang gidugang atol sa pag-andam, samtang ang insulin/TPP mixture gipadayon nga makanunayon. Ang Insulin NPs giandam sa pH range nga 4.0 ngadto sa 6.5 pinaagi sa maampingong pagkontrol sa pH sa mixture human idugang ang tanang solusyon (insulin, TPP ug CS). Ang EE ug particle size sa insulin nanoparticles gisusi sa nagkalain-laing pH values ​​ug CS/insulin mass ratios aron ma-optimize ang pagporma sa insulin NPs.
Ang gi-optimize nga insulin NPs gibutang sa aluminum nga sudlanan ug gitabonan og tissue nga gihigpitan og tape. Pagkahuman, ang mga tornilyo nga sudlanan gibutang sa usa ka Labconco FreeZone freeze dryer (Labconco, Kansas City, MO, USA) nga adunay tray dryer. Ang temperatura ug vacuum pressure gibutang sa -10 °C, 0.350 Torr sa unang 2 ka oras, ug 0 °C ug 0.120 Torr sa nahibiling 22 ka oras sa 24 ka oras aron makakuha og uga nga insulin NPs.
Ang Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Switzerland) gigamit sa pagmugna og encapsulated insulin. Ang napili nga mga parametro sa pagpauga mao ang: temperatura nga 100 °C, feed flow 3 L/min, ug gas flow 4 L/min.
Ang mga Insulin NP sa wala pa ug pagkahuman sa dehydration gi-characterize gamit ang FTIR-ATR spectroscopy. Ang mga dehydrated nanoparticles ingon man ang libre nga insulin ug chitosan gi-analisa gamit ang Spectrum 100 FTIR spectrophotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) nga adunay universal ATR sampling accessory (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Ang mga signal average nakuha gikan sa 16 ka scan sa resolusyon nga 4 cm2 sa frequency range nga 4000-600 cm2.
Ang morpolohiya sa mga dry insulin NP gisusi pinaagi sa mga imahe sa SEM sa freeze-dried ug spray-dried insulin NP nga nakuha sa usa ka Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Ang pangunang parametro nga gigamit mao ang boltahe nga 5 keV ug kuryente nga 30 mA.
Ang tanang dehydrated insulin NPs gitunaw pag-usab sa dd nga tubig. Ang gidak-on sa partikulo, PDI, EE ug LC gisulayan pag-usab gamit ang parehas nga pamaagi nga nahisgutan ganina aron masusi ang ilang kalidad pagkahuman sa dehydration. Ang kalig-on sa anhydroinsulin NPs gisukod usab pinaagi sa pagsulay sa mga kabtangan sa NPs pagkahuman sa dugay nga pagtipig. Niini nga pagtuon, ang tanan nga NPs pagkahuman sa dehydration gitipigan sa refrigerator sulod sa tulo ka bulan. Pagkahuman sa tulo ka bulan nga pagtipig, ang NPs gisulayan alang sa morphological particle size, PDI, EE ug LC.
Tunawa ang 5 mL sa gi-reconstitute nga NPs sa 45 mL nga adunay simulated gastric fluid (pH 1.2, nga adunay 1% pepsin), intestinal fluid (pH 6.8, nga adunay 1% trypsin) o chymotrypsin solution (100 g/mL, sa phosphate buffer, pH 7.8) aron masusi ang kaepektibo sa insulin sa pagpanalipod sa mga NP human sa dehydration. Gi-incubate sila sa 37°C nga adunay agitation speed nga 100 rpm. 500 μL sa solusyon ang gikolekta sa lain-laing mga oras ug ang konsentrasyon sa insulin gitino pinaagi sa HPLC.
Ang in vitro release behavior sa bag-ong giandam ug dehydrated nga insulin NPs gisulayan pinaagi sa dialysis bag method (molecular weight cut-off 100 kDa, Spectra Por Inc.). Ang bag-ong giandam ug gi-reconstitute nga uga nga NPs gi-dialyzed sa mga pluwido sa pH 2.5, pH 6.6, ug pH 7.0 (0.1 M phosphate-buffered saline, PBS) aron ma-simulate ang pH environment sa tiyan, duodenum, ug ibabaw nga gamay nga tinai, matag usa. Ang tanan nga mga sample gi-incubate sa 37 °C nga padayon nga giuyog sa 200 rpm. I-aspirate ang pluwido sa gawas sa 5 mL dialysis bag sa mosunod nga mga oras: 0.5, 1, 2, 3, 4, ug 6 ka oras, ug dayon pun-i ang volume gamit ang presko nga dialysate. Ang kontaminasyon sa insulin sa pluwido gisusi pinaagi sa HPLC, ug ang rate sa pagpagawas sa insulin gikan sa mga nanoparticle gikalkulo gikan sa ratio sa libre nga insulin nga gipagawas sa kinatibuk-ang insulin nga gisulod sa mga nanoparticle (Equation 3).
Ang mga selula sa human hepatocellular carcinoma cell line nga HepG2 gipatubo sa mga plato nga may diyametro nga 60 mm gamit ang Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) nga adunay 10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin, ug 100 μg/mL streptomycin29. Ang mga kultura gimentinar sa 37°C, 95% relative humidity, ug 5% CO2. Alang sa uptake assays, ang mga selula sa HepG2 gipugas sa 1 × 105 cells/ml ngadto sa 8-well Nunc Lab-Tek chamber slide system (Thermo Fisher, NY, USA). Alang sa cytotoxicity assays, kini gipugas sa 96-well plates (Corning, NY, USA) sa density nga 5 × 104 cells/ml.
Ang MTT assay gigamit aron masusi ang cytotoxicity sa bag-ong giandam ug gi-dehydrate nga insulin NPs30. Ang mga HepG2 cells gipugas sa 96-well plates sa density nga 5 × 104 cells/mL ug gi-culture sulod sa 7 ka adlaw sa dili pa ang pagsulay. Ang mga Insulin NPs gi-dilute sa lain-laing konsentrasyon (50 hangtod 500 μg/mL) sa culture medium ug dayon gihatag sa mga cells. Pagkahuman sa 24 oras nga incubation, ang mga cells gihugasan sa 3 ka beses gamit ang PBS ug gi-incubate sa medium nga adunay 0.5 mg/ml MTT sulod sa dugang nga 4 ka oras. Ang cytotoxicity gisusi pinaagi sa pagsukod sa enzymatic reduction sa yellow tetrazolium MTT ngadto sa purple formazan sa 570 nm gamit ang Tecan infinite M200 pro spectrophotometer plate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland).
Ang cellular uptake efficiency sa mga NP gisulayan pinaagi sa confocal laser scanning microscopy ug flow cytometry analysis. Ang matag well sa Nunc Lab-Tek chamber slide system gitambalan og free FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NPs, ug gi-reconstitute ang 25 μg/mL sa dehydrated FITC-insulin NPs sa parehas nga konsentrasyon ug gi-incubate sulod sa 4 ka oras. Ang mga cell gihugasan og 3 ka beses gamit ang PBS ug gi-fix og 4% paraformaldehyde. Ang mga nuclei gi-stain og 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Ang insulin localization naobserbahan gamit ang Olympus FV1000 laser scanning/two-photon confocal microscope (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). Para sa flow cytometry analysis, ang parehas nga konsentrasyon sa 10 μg/mL free FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NPs, ug resolubilized dehydrated FITC-insulin NPs gidugang sa 96-well plates nga gi-seed og HepG2 cells ug gi-incubate sulod sa 4 ka oras. 4 ka oras. Human sa 4 ka oras nga incubation, ang mga selula gikuha ug gihugasan sa 3 ka beses gamit ang FBS. 5 × 104 ka selula matag sample ang gisusi gamit ang BD LSR II flow cytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Estados Unidos).
Ang tanang kantidad gipahayag isip mean ± standard deviation. Ang mga pagtandi tali sa tanang grupo gisusi gamit ang one-way ANOVA o t-test sa IBM SPSS Statistics 26 para sa Mac (IBM, Endicott, New York, USA) ug ang p < 0.05 giisip nga statistically significant.
Kini nga pagtuon nagpakita sa pagka-flexible ug abilidad sa spray drying sa pag-dehydrate sa cross-linked chitosan/TPP/insulin nanoparticles nga adunay mas maayong reconstitution kon itandi sa standard freeze-drying methods gamit ang bulking agents o cryoprotectants capacity ug mas taas nga load capacity. Ang na-optimize nga insulin nanoparticles naghatag og average particle size nga 318 nm ug encapsulation efficiency nga 99.4%. Ang mga resulta sa SEM ug FTIR human sa dehydration nagpakita nga ang spherical structure gimentinar lamang sa spray-dried NPs nga adunay ug walay mannitol ug lyophilized gamit ang mannitol, apan ang lyophilized NPs nga walay mannitol nadugta atol sa dehydration. Sa reconstitution ability test, ang insulin nanoparticles nga spray-dried nga walay mannitol nagpakita sa pinakagamay nga mean particle size ug ang pinakataas nga loading sa reconstitution. Ang release behaviors sa tanan niining dehydrated NPs nagpakita nga kini paspas nga gipagawas sa mga solusyon nga pH = 2.5 ug pH = 7, ug lig-on kaayo sa solusyon nga pH = 6.5. Kon itandi sa ubang redissolved dehydrated NPs, ang NPs Ang spray-dried nga walay mannitol nagpakita sa pinakapaspas nga pagpagawas. Kini nga resulta nahiuyon sa naobserbahan sa cellular uptake assay, tungod kay ang spray-dried NPs nga walay mannitol halos hingpit nga nagmintinar sa cellular uptake efficiency sa bag-ong giandam nga NPs. Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang dry insulin nanoparticles nga giandam pinaagi sa mannitol-free spray drying labing angay alang sa dugang nga pagproseso ngadto sa ubang anhydrous dosage forms, sama sa oral tablets o bioadhesive films.
Tungod sa mga isyu sa intellectual property, ang mga dataset nga nahimo ug/o gisusi atol sa kasamtangang pagtuon dili magamit sa publiko, apan magamit gikan sa tagsa-tagsa ka mga awtor kon adunay makatarunganong hangyo.
Kagan, A. Type 2 diabetes: sosyal ug siyentipikong gigikanan, mga komplikasyon sa medisina, ug mga implikasyon alang sa mga pasyente ug sa uban. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Ang pag-uswag sa insulin encapsulation: posible na ba ang oral nga administrasyon karon? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Bag-ong mga pag-uswag sa oral insulin-loaded liposome delivery systems para sa pagtambal sa diabetes.Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).