Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Para sa labing maayong resulta, among girekomendar nga mogamit ka og mas bag-ong bersyon sa imong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among gipakita ang site nga walay styling o JavaScript.
Ang propionic acid (PPA) gigamit sa pagtuon sa papel sa mitochondrial dysfunction sa mga neurodevelopmental disorder sama sa autism spectrum disorder. Ang PPA nailhan nga makabalda sa mitochondrial biogenesis, metabolismo, ug turnover. Bisan pa, ang mga epekto sa PPA sa mitochondrial dynamics, fission ug fusion nagpabilin nga problema tungod sa komplikado nga temporal nga kinaiya niini nga mga mekanismo. Dinhi, gigamit namo ang mga complementary quantitative imaging techniques aron imbestigahan kung giunsa makaapekto ang PPA sa mitochondrial ultrastructure, morphology, ug dynamics sa mga neuron-like SH-SY5Y cells. Ang PPA (5 mM) hinungdan sa usa ka dakong pagkunhod sa mitochondrial area (p < 0.01), Feret diameter ug circumference (p < 0.05), ug area 2 (p < 0.01). Ang Mitochondrial event locator analysis nagpakita og dakong pagtaas (p < 0.05) sa fission ug fusion events, sa ingon nagmintinar sa integridad sa mitochondrial network ubos sa mga kondisyon sa stress. Dugang pa, ang mRNA expression sa cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) ug OPA1 (p < 0.05) mikunhod pag-ayo. 01). Kini nagpakita sa pagbag-o sa mitochondrial morphology, biogenesis ug dynamics aron mapadayon ang function ubos sa mga kondisyon sa stress. Ang among datos naghatag og bag-ong panabut sa mga epekto sa PPA sa mitochondrial dynamics ug nagpasiugda sa gamit sa mga teknik sa imaging alang sa pagtuon sa komplikado nga mga mekanismo sa regulasyon nga nalambigit sa mga tubag sa stress sa mitochondrial.
Ang mitochondria mga importanteng partisipante sa lain-laing mga gimbuhaton sa selula lapas sa ilang kasagarang papel sa produksiyon sa enerhiya ug biosynthesis. Ang metabolismo sa mitochondrial usa ka importanteng regulator sa calcium signaling, metabolic ug redox homeostasis, inflammatory signaling, epigenetic modifications, cell proliferation, differentiation ug programmed cell death1. Sa partikular, ang metabolismo sa mitochondrial importante alang sa neuronal development, survival ug function ug kaylap nga nalambigit sa lain-laing mga manipestasyon sa neuropathology2,3,4.
Sulod sa miaging dekada, ang metabolic status mitumaw isip usa ka sentral nga regulator sa neurogenesis, differentiation, maturation ug plasticity5,6. Bag-ohay lang, ang mitochondrial morphology ug dynamics nahimong labi ka hinungdanon nga mga sangkap sa mitosis, usa ka dinamikong proseso nga nagmintinar sa usa ka pundok sa himsog nga mitochondria sulod sa mga selula. Ang mitochondrial dynamics gi-regulate sa komplikado nga interdependent pathways gikan sa mitochondrial biogenesis ug bioenergetics hangtod sa mitochondrial fission, fusion, transport ug clearance7,8. Ang pagkabalda sa bisan hain niining mga integrative mechanism makadaot sa pagmentinar sa himsog nga mitochondrial networks ug adunay lawom nga functional consequences alang sa neurodevelopment9,10. Sa tinuud, ang dysregulation sa mitochondrial dynamics naobserbahan sa daghang psychiatric, neurodegenerative ug neurodevelopmental disorders, lakip ang autism spectrum disorders (ASD)11,12.
Ang ASD usa ka heterogeneous neurodevelopmental disorder nga adunay komplikado nga genetic ug epigenetic architecture. Ang heritability sa ASD dili ikalimod, apan ang nagpahiping molecular etiology nagpabilin nga dili kaayo masabtan. Ang pagtigom og datos gikan sa preclinical models, clinical studies, ug multi-omics molecular datasets naghatag og nagkadako nga ebidensya sa mitochondrial dysfunction sa ASD13,14. Kaniadto, naghimo kami og genome-wide DNA methylation screen sa usa ka cohort sa mga pasyente nga adunay ASD ug nakaila sa differentially methylated genes nga nag-cluster ubay sa mitochondrial metabolic pathways15. Pagkahuman, among gitaho ang differential methylation sa central regulators sa mitochondrial biogenesis ug dynamics, nga nalangkit sa pagtaas sa mtDNA copy number ug giusab nga urinary metabolic profile sa ASD16. Ang among datos naghatag og nagkadako nga ebidensya nga ang mitochondrial dynamics ug homeostasis adunay sentral nga papel sa pathophysiology sa ASD. Busa, ang pagpalambo sa mechanistic nga pagsabot sa relasyon tali sa mitochondrial dynamics, morphology, ug function usa ka importanteng tumong sa padayon nga panukiduki sa mga sakit sa neurological nga gihulagway sa secondary mitochondrial dysfunction.
Ang mga teknik sa molekula kanunay nga gigamit sa pagtuon sa papel sa piho nga mga gene sa mga tubag sa stress sa mitochondrial. Bisan pa, kini nga pamaagi mahimong limitado sa multifaceted ug temporal nga kinaiya sa mga mekanismo sa pagkontrol sa mitotic. Dugang pa, ang lainlaing ekspresyon sa mga gene sa mitochondrial usa ka dili direkta nga timailhan sa mga pagbag-o sa pag-andar, labi na tungod kay limitado ra ang gidaghanon sa mga gene nga kasagarang gisusi. Busa, gisugyot ang mas direkta nga mga pamaagi alang sa pagtuon sa function sa mitochondrial ug bioenergetics17. Ang morpolohiya sa mitochondrial suod nga nalambigit sa dinamika sa mitochondrial. Ang porma, koneksyon, ug istruktura sa mitochondrial hinungdanon alang sa paghimo og enerhiya ug pagkabuhi sa mitochondrial ug cell5,18. Dugang pa, ang lainlaing mga sangkap sa mitosis nagpunting sa mga pagbag-o sa morpolohiya sa mitochondrial, nga mahimong magsilbing mapuslanon nga mga endpoint sa mitochondrial dysfunction ug maghatag usa ka basehan alang sa sunod nga mga pagtuon sa mekanismo.
Ang morpolohiya sa mitochondrial mahimong direktang maobserbahan gamit ang transmission electron microscopy (TEM), nga nagtugot sa detalyado nga pagtuon sa cellular ultrastructure. Ang TEM direktang nag-visualize sa morpolohiya, porma, ug istruktura sa mitochondrial cristae sa resolusyon sa indibidwal nga mitochondria, imbes nga magsalig lamang sa gene transcription, protein expression, o mitochondrial functional parameters sa mga populasyon sa selula17,19,20. Dugang pa, ang TEM nagpadali sa pagtuon sa mga interaksyon tali sa mitochondria ug uban pang mga organelle, sama sa endoplasmic reticulum ug autophagosomes, nga adunay hinungdanon nga papel sa mitochondrial function ug homeostasis21,22. Busa, kini naghimo sa TEM nga usa ka maayong sinugdanan alang sa pagtuon sa mitochondrial dysfunction sa dili pa mag-focus sa piho nga mga pathway o gene. Samtang ang mitochondrial function nahimong labi ka may kalabutan sa neuropathology, adunay klaro nga panginahanglan nga makahimo sa direkta ug quantitative nga pagtuon sa mitochondrial morphology ug dynamics sa in vitro neuronal models.
Niini nga artikulo, among gisusi ang mitochondrial dynamics sa usa ka neuronal model sa mitochondrial dysfunction sa autism spectrum disorder. Among gitaho kaniadto ang differential methylation sa propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) sa ASD15, usa ka subunit sa mitochondrial propionyl-CoA carboxylase enzyme PCC. Ang dysregulation sa PCC nailhan nga hinungdan sa makahilong akumulasyon sa propionyl derivatives, lakip ang propionic acid (PPA)23,24,25. Ang PPA napamatud-an nga makabalda sa neuronal metabolism ug makausab sa pamatasan in vivo ug usa ka natukod nga animal model alang sa pagtuon sa mga neurodevelopmental mechanism nga nalambigit sa ASD26,27,28. Dugang pa, ang PPA gitaho nga makabalda sa mitochondrial membrane potential, biogenesis ug respiration in vitro ug kaylap nga gigamit sa pag-modelo sa mitochondrial dysfunction sa neurons29,30. Bisan pa, ang epekto sa PPA-induced mitochondrial dysfunction sa mitochondrial morphology ug dynamics nagpabilin nga dili kaayo masabtan.
Kini nga pagtuon naggamit ug mga complementary imaging techniques aron masukod ang mga epekto sa PPA sa mitochondrial morphology, dynamics, ug function sa mga SH-SY5Y cells. Una, naghimo kami ug TEM method aron ma-visualize ang mga pagbag-o sa mitochondrial morphology ug ultrastructure17,31,32. Tungod sa dinamikong kinaiya sa mitochondria33, gigamit usab namo ang mitochondrial event localizer (MEL) analysis aron masukod ang mga pagbag-o sa balanse tali sa fission ug fusion events, mitochondrial number ug volume ubos sa PPA stress. Sa katapusan, gisusi namo kung ang mitochondrial morphology ug dynamics nalangkit ba sa mga pagbag-o sa ekspresyon sa mga gene nga nalambigit sa biogenesis, fission, ug fusion. Kung tan-awon sa kinatibuk-an, ang among datos nagpakita sa hagit sa pagpatin-aw sa pagkakomplikado sa mga mekanismo nga nag-regulate sa mitochondrial dynamics. Gipasiugda namo ang gamit sa TEM sa pagtuon sa mitochondrial morphology isip usa ka masukod nga convergent endpoint sa mitosis sa mga SH-SY5Y cells. Dugang pa, gipasiugda namo nga ang TEM data naghatag sa pinakadato nga impormasyon kung giubanan sa mga imaging techniques nga nakakuha usab sa mga dinamikong panghitabo isip tubag sa metabolic stress. Ang dugang nga pag-characterize sa mga molecular regulatory mechanisms nga nagsuporta sa neuronal cell mitosis mahimong makahatag ug importanteng panabut sa mitochondrial component sa nervous system ug neurodegenerative diseases.
Aron ma-induce ang mitochondrial stress, ang mga SH-SY5Y cells gitambalan gamit ang PPA gamit ang 3 mM ug 5 mM sodium propionate (NaP). Sa wala pa ang TEM, ang mga sample gipailalom sa cryogenic sample preparation gamit ang high-pressure freezing ug freezing (Fig. 1a). Naghimo kami og automated mitochondrial image analysis pipeline aron masukod ang walo ka morphological parameters sa mitochondrial populations sa tulo ka biological replicates. Nakita namo nga ang PPA treatment nakapausab pag-ayo sa upat ka parameters: area 2, area, perimeter, ug Feret diameter (Fig. 1b–e). Ang Area 2 mikunhod pag-ayo sa 3 mM ug 5 mM PPA treatment (p = 0.0183 ug p = 0.002, matag usa) (Fig. 1b), samtang ang area (p = 0.003), perimeter (p = 0.0106) ug Feret diameter tanan mikunhod pag-ayo. Adunay dakong pagkunhod (p = 0.0172) sa 5 mM treatment group kon itandi sa control group (Fig. 1c–e). Ang dakong pagkunhod sa gilapdon ug sirkumperensiya nagpakita nga ang mga selula nga gitambalan og 5 mM PPA adunay mas gagmay ug mas lingin nga mitochondria, ug nga kini nga mga mitochondria dili kaayo taas kay sa mga naa sa control cells. Kini nahiuyon usab sa dakong pagkunhod sa diametro sa Feret, usa ka independente nga parameter nga nagpakita sa pagkunhod sa pinakadako nga distansya tali sa mga ngilit sa partikulo. Naobserbahan ang mga pagbag-o sa ultrastructure sa cristae: ang cristae nahimong dili kaayo klaro ubos sa impluwensya sa stress sa PPA (Fig. 1a, panel B). Bisan pa, dili tanan nga mga imahe klaro nga nagpakita sa ultrastructure sa cristae, mao nga wala gihimo ang usa ka quantitative analysis niini nga mga pagbag-o. Kini nga datos sa TEM mahimong magpakita sa tulo ka posible nga mga senaryo: (1) Ang PPA nagpalambo sa fission o nagpugong sa fusion, hinungdan nga ang kasamtangan nga mitochondria mokunhod sa gidak-on; (2) ang gipauswag nga biogenesis nagmugna og bag-o ug mas gagmay nga mitochondria o (3) nag-induce sa duha ka mekanismo sa dungan. Bisan kung kini nga mga kondisyon dili mailhan sa TEM, ang hinungdanon nga mga pagbag-o sa morphological nagpakita sa mga pagbag-o sa mitochondrial homeostasis ug dynamics ubos sa stress sa PPA. Pagkahuman among gisusi ang dugang nga mga parameter aron labi nga mailhan kini nga mga dinamika ug ang potensyal nga mga mekanismo nga nagpahiping niini.
Ang propionic acid (PPA) nag-remodel sa mitochondrial morphology. (a) Mga hulagway sa representative transmission electron microscopy (TEM) nga nagpakita nga ang gidak-on sa mitochondrial mikunhod ug ang mitochondria nahimong mas gamay ug mas lingin uban sa pagdugang sa pagtambal sa PPA; 0 mM (wala matambali), 3 mM ug 5 mM, matag usa. Ang pula nga mga pana nagpakita sa mitochondria. (b–e) Ang mga selula sa SH-SY5Y nga gitambalan sa PPA sulod sa 24 oras giandam alang sa TEM ug ang mga resulta gisusi gamit ang Fiji/ImageJ. Upat sa walo ka mga parameter nagpakita og hinungdanon nga mga kalainan tali sa control (wala matambali, 0 mM PPA) ug gitambalan (3 mM ug 5 mM PPA) nga mga selula. (b) Rehiyon 2, (c) Lugar, (d) Perimeter, (e) Diametro sa Feret. Ang one-way analysis sa variance (control vs. treatment) ug Dunnett's multiple comparison test gigamit aron mahibal-an ang hinungdanon nga mga kalainan (p < 0.05). Ang mga punto sa datos nagrepresentar sa aberids nga kantidad sa mitochondrial alang sa matag indibidwal nga selula, ug ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± SEM. Ang datos nga gipakita nagrepresentar sa n = 3, labing menos 24 ka mga selula matag replicate; usa ka total nga 266 ka mga imahe ang gisusi; * nagpakita nga p < 0.05, ** nagpakita nga p < 0.01.
Aron mas mailhan pa kon giunsa pagtubag sa mitochondrial dynamics ang PPA, among gi-stain ang mitochondria gamit ang tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ug migamit og time-lapse microscopy ug MEL analysis aron ma-localize ug ma-quantify ang mitochondria human sa 24 oras sa 3 ug 5 mM PPA. Pagtambal sa mga panghitabo sa fission ug fusion. (Fig. 2a). Human sa MEL analysis, ang mitochondria gi-analisa pa aron ma-quantify ang gidaghanon sa mga istruktura sa mitochondrial ug ang ilang average nga volume. Nakamatikod kami og gamay apan dakong pagtaas sa gidaghanon sa mga panghitabo sa fission nga nahitabo sa 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] kon itandi sa fission [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] ug ang fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ug fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] nga mga panghitabo miusbaw pag-ayo sa 5 mM kon itandi sa control (Fig. 3b). Ang gidaghanon sa mitochondria misaka pag-ayo sa 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ug 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), samtang ang aberids nga gidaghanon sa matag istruktura sa mitochondrial wala mausab (Fig. 3c). 3d). Kung tan-awon sa kinatibuk-an, kini nagsugyot nga ang pag-remodel sa mitochondrial dynamics nagsilbi nga usa ka compensatory response nga malampuson nga nagmintinar sa integridad sa mitochondrial network. Ang pagtaas sa gidaghanon sa mga panghitabo sa fission sa 3 mM PPA nagsugyot nga ang pagtaas sa gidaghanon sa mitochondrial tungod sa mitochondrial fission, apan tungod kay ang aberids nga gidaghanon sa mitochondrial nagpabilin nga halos wala mausab, ang biogenesis dili mahimong isalikway isip usa ka dugang nga compensatory response. Bisan pa, kini nga datos nahiuyon sa mas gagmay, lingin nga mga istruktura sa mitochondrial nga naobserbahan sa TEM ug nagpakita usab og mga hinungdanon nga pagbag-o sa mitochondrial dynamics nga gipahinabo sa PPA.
Ang propionic acid (PPA) nag-induce sa dynamic mitochondrial remodeling aron mapadayon ang integridad sa network. Ang mga SH-SY5Y cells gi-culture, gitambalan og 3 ug 5 mM PPA sulod sa 24 oras ug gi-stain gamit ang TMRE ug Hoechst 33342 gisundan sa MEL analysis. (a) Representative time-lapse microscopy images nga nagpakita sa kolor ug binarized maximum intensity projections sa time 2 (t2) para sa matag kondisyon. Ang pinili nga mga rehiyon nga gipakita sa matag binary image gi-enhance ug gipakita sa 3D sa tulo ka lain-laing time frames (t1-t3) aron iilustrar ang dynamics sa paglabay sa panahon; ang mga fusion events gi-highlight sa berde; ang mga fission events gi-highlight sa berde. Gipakita sa pula. (b) Average nga gidaghanon sa mga dynamic events kada kondisyon. (c) Average nga gidaghanon sa mga mitochondrial structures kada cell. (d) Average nga volume (µm3) sa matag mitochondrial structure kada cell. Ang data nga gipakita nagrepresentar sa n = 15 ka cells kada treatment group. Ang mga error bar nga gipakita nagrepresentar sa mean ± SEM, scale bar = 10 μm, * p < 0.05.
Ang propionic acid (PPA) hinungdan sa transcriptional suppression sa mga gene nga nalangkit sa mitochondrial dynamics. Ang mga SH-SY5Y cells gitambalan gamit ang 3 ug 5 mM PPA sulod sa 24 oras. Ang relative gene quantification gihimo gamit ang RT-qPCR ug gi-normalize sa B2M. Ang mga mitochondrial biogenesis genes (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ug (d) NFE2L2. Ang mga mitochondrial fusion ug fission genes (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ug (i) DRP1. Ang mga significant nga kalainan (p < 0.05) gisulayan gamit ang one-way ANOVA (control vs. treatment) ug Dunnett's multiple comparison test: * nagpakita og p < 0.05, ** nagpakita og p < 0.01, ug **** nagpakita og p < 0.0001. Ang mga bar nagrepresentar sa mean expression ± SEM. Ang datos nga gipakita nagrepresentar sa n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), ug n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) nga mga biyolohikal nga replika.
Ang datos gikan sa mga pag-analisa sa TEM ug MEL nagpakita nga ang PPA nag-usab sa morpolohiya ug dinamika sa mitochondrial. Bisan pa, kini nga mga teknik sa imaging wala maghatag og panabut sa nagpahiping mga mekanismo nga nagduso niini nga mga proseso. Busa, among gisusi ang ekspresyon sa mRNA sa siyam ka hinungdanon nga regulator sa mitochondrial dynamics, biogenesis, ug mitosis isip tubag sa pagtambal sa PPA. Among gi-quantify ang cell myeloma oncogene (cMYC), nuclear respiratory factor (NRF1), mitochondrial transcription factor 1 (TFAM), NFE2-like transcription factor BZIP (NFE2L2), gastrin-like protein 2 (STOML2), optic nerve atrophy 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) ug dynamin-related protein 1 (DRP1) human sa 24 oras nga pagtambal gamit ang 3 mM ug 5 mM PPA. Nakakita mig 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 ug p < 0.0001, matag usa) ug 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) nga pagtambal gamit ang PPA. (Fig. 3a–c). Ang pagkunhod sa ekspresyon sa mRNA nagdepende sa dosis: ang ekspresyon sa cMYC, NRF1 ug TFAM mikunhod og 5.7, 2.6 ug 1.9 ka beses sa 3 mM, matag usa, ug 11.2, 3 ug 2.2 ka beses sa 5 mM. Sa kasukwahi, ang central redox biogenesis gene nga NFE2L2 wala mausab sa bisan unsang konsentrasyon sa PPA, bisan pa man og susamang dose-dependent nga uso sa pagkunhod sa ekspresyon ang naobserbahan (Fig. 3d).
Gisusi usab namo ang ekspresyon sa mga klasikal nga gene nga nalambigit sa regulasyon sa fission ug fusion. Ang STOML2 gituohan nga nalambigit sa fusion, mitophagy ug biogenesis, ug ang ekspresyon niini mikunhod pag-ayo (p < 0.0001) sa 3 mM (2.4-pilo nga pagbag-o) ug 5 mM (2.8-pilo nga pagbag-o) PPA (Fig. 1). 3d). Sa susama, ang ekspresyon sa gene sa OPA1 fusion mikunhod sa 3 mM (1.6-pilo nga pagbag-o) ug 5 mM (1.9-pilo nga pagbag-o) PPA (p = 0.006 ug p = 0.0024, matag usa) (Fig. 3f). Bisan pa, wala kami nakakita og hinungdanon nga mga kalainan sa ekspresyon sa mga gene sa fusion nga MFN1, MFN2 o fission gene nga DRP1 ubos sa 24-oras nga stress sa PPA (Fig. 3g–i). Dugang pa, among nakita nga ang lebel sa upat ka fusion ug fission proteins (OPA1, MFN1, MFN2 ug DRP1) wala mausab ubos sa parehas nga mga kondisyon (Fig. 4a–d). Importante nga matikdan nga kini nga datos nagpakita sa usa ka punto sa panahon ug mahimong dili magpakita sa mga pagbag-o sa ekspresyon sa protina o lebel sa kalihokan sa mga sayong yugto sa stress sa PPA. Bisan pa, ang hinungdanon nga pagkunhod sa ekspresyon sa cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ug OPA1 nagpakita sa hinungdanon nga transcriptional dysregulation sa mitochondrial metabolism, biogenesis, ug dynamics. Dugang pa, kini nga datos nagpasiugda sa gamit sa mga teknik sa imaging aron direktang tun-an ang mga pagbag-o sa end-state sa mitochondrial function.
Ang lebel sa protina sa fusion ug fission factor wala mausab human sa pagtambal sa propionic acid (PPA). Ang mga SH-SY5Y cell gitambalan og 3 ug 5 mM PPA sulod sa 24 oras. Ang lebel sa protina gikwenta pinaagi sa Western blot analysis, ug ang lebel sa ekspresyon gi-normalize sa kinatibuk-ang protina. Gipakita ang aberids nga ekspresyon sa protina ug ang representatibong Western blots sa target ug kinatibuk-ang protina. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Ang mga bar nagrepresentar sa mean ± SEM, ug ang datos nga gipakita nagrepresentar sa n = 3 ka biological replicates. Daghang mga pagtandi (p < 0.05) ang gihimo gamit ang one-way analysis of variance ug Dunnett's test. Ang orihinal nga gel ug blot gipakita sa Figure S1.
Ang mitochondrial dysfunction nalangkit sa mga sakit nga multisystem gikan sa metabolic, cardiovascular ug muscular diseases ngadto sa neurological diseases1,10. Daghang neurodegenerative ug neurodegenerative nga mga sakit ang nalangkit sa mitochondrial dysfunction, nga nagpasiugda sa kamahinungdanon niining mga organelle sa tibuok kinabuhi sa utok. Kini nga mga sakit naglakip sa Parkinson's disease, Alzheimer's disease ug ASD3,4,18. Bisan pa, ang pag-access sa tisyu sa utok aron tun-an kini nga mga sakit lisud, labi na sa lebel sa mekanismo, nga naghimo sa mga cellular model system nga usa ka kinahanglanon nga alternatibo. Niini nga pagtuon, gigamit namo ang usa ka cellular model system nga naggamit sa PPA-treated SH-SY5Y cells aron i-recapitulate ang mitochondrial dysfunction nga naobserbahan sa mga neuronal diseases, labi na ang autism spectrum disorders. Ang paggamit niini nga PPA model aron tun-an ang mitochondrial dynamics sa mga neuron mahimong makahatag og panabut sa etiology sa ASD.
Among gisusi ang posibilidad sa paggamit sa TEM aron makita ang mga pagbag-o sa mitochondrial morphology. Importante nga matikdan nga ang TEM kinahanglan gamiton sa husto aron mapadako ang kaepektibo niini. Ang pag-andam sa mga cryo-specimen nagtugot sa mas maayong pagpreserbar sa mga neuronal structure pinaagi sa dungan nga pag-ayo sa mga cellular component ug pagpakunhod sa pagporma sa mga artifact34. Subay niini, among naobserbahan nga ang mga neuron-like SH-SY5Y cells adunay intact subcellular organelles ug elongated mitochondria (Fig. 1a). Kini nagpasiugda sa gamit sa cryogenic preparation techniques alang sa pagtuon sa mitochondrial morphology sa mga neuronal cell model. Bisan tuod ang quantitative measurements importante alang sa objective analysis sa TEM data, wala gihapoy consensus kung unsang espesipikong mga parameter ang kinahanglan sukdon aron makumpirma ang mga pagbag-o sa mitochondrial morphology. Base sa daghang mga pagtuon nga quantitatively nga nagsusi sa mitochondrial morphology17,31,32, naghimo kami og automated mitochondrial image analysis pipeline nga nagsukod sa walo ka morphological parameters, nga mao ang: area, area2, aspect ratio, perimeter, circularity, degree, Feret diameter, ug roundness.
Lakip niini, ang PPA mikunhod pag-ayo sa area 2, area, perimeter, ug diametro sa Feret (Fig. 1b–e). Kini nagpakita nga ang mitochondria nahimong mas gamay ug mas lingin, nga nahiuyon sa mga nangaging pagtuon nga nagpakita sa pagkunhod sa mitochondrial area pagkahuman sa 72 ka oras nga PPA30-induced mitochondrial stress. Kini nga mga morphological feature mahimong magpakita sa mitochondrial fission, usa ka kinahanglanon nga proseso aron ma-sequester ang mga nadaot nga sangkap gikan sa mitochondrial network aron mapalambo ang ilang pagkadaot pinaagi sa mitophagy35,36,37. Sa laing bahin, ang pagkunhod sa aberids nga gidak-on sa mitochondrial mahimong nalangkit sa pagtaas sa biogenesis, nga moresulta sa pagporma sa gagmay nga bag-ong mitochondria. Ang pagtaas sa fission o biogenesis nagrepresentar sa usa ka compensatory nga tubag aron mapadayon ang mitosis batok sa mitochondrial stress. Bisan pa, ang pagkunhod sa pagtubo sa mitochondrial, pagkadaot sa fusion, o uban pang mga kondisyon dili mahimong isalikway.
Bisan tuod ang mga hulagway nga taas og resolusyon nga gihimo sa TEM nagtugot sa pagtino sa mga kinaiya sa morpolohiya sa lebel sa indibidwal nga mitochondria, kini nga pamaagi nagpatunghag duha ka dimensyon nga mga snapshot sa usa ka punto sa oras. Aron tun-an ang dinamikong mga tubag sa metabolic stress, among gipintalan ang mitochondria gamit ang TMRE ug gigamit ang time-lapse microscopy nga adunay MEL analysis, nga nagtugot sa high-throughput nga 3D visualization sa mga pagbag-o sa mitochondrial network sa paglabay sa panahon33,38. Nakamatikod kami og gamay apan hinungdanon nga mga pagbag-o sa mitochondrial dynamics ubos sa PPA stress (Fig. 2). Sa 3 mM, ang gidaghanon sa mga panghitabo sa fission misaka pag-ayo, samtang ang mga panghitabo sa fusion nagpabilin nga parehas sa kontrol. Usa ka pagtaas sa gidaghanon sa mga panghitabo sa fission ug fusion ang naobserbahan sa 5 mM PPA, apan kini nga mga pagbag-o halos proporsyonal, nga nagsugyot nga ang fission ug fusion kinetics nakaabot sa equilibrium sa mas taas nga konsentrasyon (Fig. 2b). Ang aberids nga gidaghanon sa mitochondrial nagpabilin nga wala mausab sa 3 ug 5 mM PPA, nga nagpakita nga ang integridad sa mitochondrial network napreserbar (Fig. 2d). Kini nagpakita sa abilidad sa dinamikong mitochondrial network sa pagtubag sa malumo nga metabolic stress aron epektibo nga mapadayon ang homeostasis nga wala hinungdan sa pagkabungkag sa network. Sa 3 mM PPA, ang pagtaas sa fission igo na aron mapalambo ang transisyon ngadto sa usa ka bag-ong equilibrium, apan gikinahanglan ang mas lawom nga kinetic remodeling isip tubag sa stress nga gipahinabo sa mas taas nga konsentrasyon sa PPA.
Ang gidaghanon sa mitochondria misaka sa duha ka konsentrasyon sa stress sa PPA, apan ang aberids nga gidaghanon sa mitochondrial wala kaayo mausab (Fig. 2c). Mahimong tungod kini sa pagtaas sa biogenesis o pagtaas sa dibisyon; bisan pa, kung walay dakong pagkunhod sa aberids nga gidaghanon sa mitochondrial, mas lagmit nga motaas ang biosynthesis. Bisan pa, ang datos sa Figure 2 nagsuporta sa paglungtad sa duha ka mekanismo sa pag-compensatory: usa ka pagtaas sa gidaghanon sa mga panghitabo sa fission, nga nahiuyon sa pag-usbaw sa mitochondrial fission, ug usa ka pagtaas sa gidaghanon sa mga panghitabo, nga nahiuyon sa mitochondrial biogenesis. Sa katapusan, ang dinamikong kompensasyon alang sa malumo nga stress mahimong maglangkob sa dungan nga mga proseso nga naglambigit sa fission, fusion, biogenesis, ug mitophagy. Bisan kung gipakita sa nangaging mga tagsulat nga ang PPA nagpalambo sa mitosis30,39 ug mitophagy29, naghatag kami og ebidensya alang sa pag-remodel sa mitochondrial fission ug fusion dynamics agig tubag sa PPA. Kini nga datos nagpamatuod sa mga pagbag-o sa morphological nga naobserbahan sa TEM ug naghatag dugang nga panabut sa mga mekanismo nga nalangkit sa PPA-induced mitochondrial dysfunction.
Tungod kay ang TEM o MEL analysis wala maghatag ug direktang ebidensya sa mga mekanismo sa regulasyon sa gene nga nagpahipi sa naobserbahan nga mga pagbag-o sa morpolohiya, among gisusi ang RNA expression sa mga gene nga nalambigit sa mitochondrial metabolism, biogenesis, ug dynamics. Ang cMYC proto-oncogene usa ka transcription factor nga nalambigit sa regulasyon sa mitochondria, glycolysis, amino acid ug fatty acid metabolism40. Dugang pa, ang cMYC nailhan nga nag-regulate sa expression sa hapit 600 ka mitochondrial genes nga nalambigit sa mitochondrial transcription, translation, ug complex assembly, lakip ang NRF1 ug TFAM41. Ang NRF1 ug TFAM duha ka sentral nga regulator sa mitosis, nga naglihok sa ubos sa PGC-1α aron ma-activate ang mtDNA replication. Kini nga pathway gi-activate sa cAMP ug AMPK signaling ug sensitibo sa energy expenditures ug metabolic stress. Gisusi usab namo ang NFE2L2, usa ka redox regulator sa mitochondrial biogenesis, aron mahibal-an kung ang mga epekto sa PPA mahimong gipaagi sa oxidative stress.
Bisan tuod ang ekspresyon sa NFE2L2 wala mausab, among nakita ang makanunayon nga pagkunhod sa ekspresyon sa cMYC, NRF1 ug TFAM nga nagdepende sa dosis human sa 24 oras nga pagtambal gamit ang 3 mM ug 5 mM PPA (Fig. 3a–c). Ang pag-ubos sa ekspresyon sa cMYC gitaho kaniadto isip tubag sa stress sa mitochondrial42, ug sa laing bahin, ang pag-ubos sa ekspresyon sa cMYC mahimong hinungdan sa mitochondrial dysfunction pinaagi sa pag-remodel sa metabolismo sa mitochondrial, koneksyon sa network, ug polarization sa membrane43. Makapainteres, ang cMYC nalambigit usab sa regulasyon sa mitochondrial fission ug fusion42,43 ug nailhan nga nagdugang sa DRP1 phosphorylation ug mitochondrial localization atol sa cell division44, ingon man nagpataliwala sa mitochondrial morphological remodeling sa neuronal stem cells45. Sa tinuud, ang mga fibroblast nga kulang sa cMYC nagpakita sa pagkunhod sa gidak-on sa mitochondrial, nga nahiuyon sa mga pagbag-o nga gipahinabo sa stress sa PPA43. Kini nga datos nagpakita sa usa ka makapaikag apan dili klaro nga relasyon tali sa cMYC ug mitochondrial dynamics, nga naghatag usa ka makapaikag nga target alang sa umaabot nga mga pagtuon sa PPA stress-induced remodeling.
Ang pagkunhod sa NRF1 ug TFAM nahiuyon sa papel sa cMYC isip usa ka importanteng transcriptional activator. Kini nga datos nahiuyon usab sa mga nangaging pagtuon sa mga selula sa kanser sa colon sa tawo nga nagpakita nga ang PPA mikunhod sa ekspresyon sa NRF1 mRNA sa 22 ka oras, nga nalangkit sa pagkunhod sa ATP ug pagtaas sa ROS46. Kini nga mga tagsulat nagtaho usab nga ang ekspresyon sa TFAM misaka sa 8.5 ka oras apan mibalik sa baseline level sa 22 ka oras. Sa kasukwahi, gipakita ni Kim et al. (2019) nga ang ekspresyon sa TFAM mRNA mikunhod pag-ayo human sa 4 ka oras nga stress sa PPA sa mga selula sa SH-SY5Y; bisan pa, pagkahuman sa 72 ka oras, ang ekspresyon sa protina sa TFAM mikunhod pag-ayo ug ang gidaghanon sa kopya sa mtDNA mikunhod pag-ayo. Busa, ang pagkunhod sa gidaghanon sa mga gene sa mitochondrial biogenesis nga among naobserbahan pagkahuman sa 24 ka oras wala magwagtang sa posibilidad nga ang pagtaas sa gidaghanon sa mitochondria nalangkit sa pagpaaktibo sa biogenesis sa mas sayo nga mga punto sa oras. Ang mga nangaging pagtuon nagpakita nga ang PPA nagpataas sa PGC-1α mRNA ug protina sa SH-SY5Y cells sa 4 ka oras ug 30 ka minuto, samtang ang propionic acid nagpalambo sa mitochondrial biogenesis sa mga calf hepatocytes pinaagi sa PGC-1α sa 12 ka oras ug 39 ka minuto. Makapainteres, ang PGC-1α dili lamang usa ka direktang transcriptional regulator sa NRF1 ug TFAM, apan gipakita usab nga nag-regulate sa kalihokan sa MFN2 ug DRP1 pinaagi sa pag-regulate sa fission ug fusion47. Kung tan-awon sa kinatibuk-an, kini nagpasiugda sa suod nga pagkabit sa mga mekanismo nga nag-regulate sa mitochondrial compensatory responses nga gipahinabo sa PPA. Dugang pa, ang among datos nagpakita sa hinungdanon nga dysregulation sa transcriptional regulation sa biogenesis ug metabolismo ubos sa stress sa PPA.
Ang mga gene nga STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ug DRP1 nalakip sa mga sentral nga regulator sa mitochondrial fission, fusion ug dynamics37,48,49. Daghan pang ubang mga gene nga nalambigit sa mitochondrial dynamics, bisan pa, ang STOML2, OPA1 ug MFN2 nakit-an kaniadto nga lainlain ang methylation sa mga cohorts sa ASD,16 ug daghang independente nga mga pagtuon ang nagtaho sa mga pagbag-o niining mga transcription factor isip tubag sa mitochondrial stress50,51. 52. Ang ekspresyon sa OPA1 ug STOML2 mikunhod pag-ayo sa 3 mM ug 5 mM nga pagtambal sa PPA (Fig. 3e, f). Ang OPA1 usa sa mga klasikal nga regulator sa mitochondrial fusion pinaagi sa direktang interaksyon sa MFN1 ug 2 ug adunay papel sa pag-remodel sa cristae ug mitochondrial morphology53. Ang tukma nga papel sa STOML2 sa mitochondrial dynamics nagpabilin nga dili klaro, apan ang ebidensya nagsugyot nga kini adunay papel sa mitochondrial fusion, biogenesis, ug mitophagy.
Ang STOML2 nalambigit sa pagmintinar sa mitochondrial respiratory coupling ug pagporma sa respiratory chain complexes54,55 ug napamatud-an nga dako kaayog epekto sa metabolic characteristics sa mga cancer cells56. Gipakita sa mga pagtuon nga ang STOML2 nagpasiugda sa mitochondrial membrane potential ug biogenesis pinaagi sa interaksyon sa BAN ug cardiolipin55, 57, 58. Dugang pa, gipakita sa mga independenteng pagtuon nga ang interaksyon tali sa STOML2 ug PINK1 nag-regulate sa mitophagy59,60. Ilabi na, ang STOML2 gitaho nga direktang nakig-interact ug nagpalig-on sa MFN2 ug adunay usab importanteng papel sa pagpalig-on sa taas nga OPA1 isoforms pinaagi sa pagpugong sa protease nga responsable sa OPA1 degradation53,61,62. Ang pagkunhod sa STOML2 expression nga naobserbahan sa mga reaksyon sa PPA mahimong makapahimo niining mga fusion protein nga mas daling madaot pinaagi sa ubiquitin- ug proteasome-dependent pathways48. Bisan tuod dili klaro ang tukmang papel sa STOML2 ug OPA1 sa dinamikong tubag sa PPA, ang pagkunhod sa ekspresyon niining mga fusion gene (Figure 3) mahimong makabalda sa balanse tali sa fission ug fusion ug mosangpot sa pagkunhod sa gidak-on sa mitochondrial (Figure 3). 1).
Sa laing bahin, ang ekspresyon sa protina sa OPA1 nagpabilin nga wala mausab pagkahuman sa 24 oras, samtang ang lebel sa mRNA ug protina sa MFN1, MFN2 o DRP1 wala kaayo mausab pagkahuman sa pagtambal sa PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Kini mahimong magpakita nga walay mga pagbag-o sa regulasyon niining mga hinungdan nga nalambigit sa mitochondrial fusion ug fission. Bisan pa, angay nga matikdan nga ang matag usa niining upat ka gene gi-regulate usab sa posttranscriptional modifications (PTMs) nga nagkontrol sa kalihokan sa protina. Ang OPA1 adunay walo ka alternatibong variant sa splice nga gi-proteolytically cleaved sa mitochondria aron makahimo og duha ka managlahing isoform 63. Ang balanse tali sa taas ug mubo nga isoform sa katapusan nagtino sa papel sa OPA1 sa mitochondrial fusion ug pagmentinar sa mitochondrial network 64. Ang kalihokan sa DRP1 gi-regulate sa calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) phosphorylation, samtang ang DRP1 degradation gi-regulate sa ubiquitination ug SUMOylation 65. Sa katapusan, ang DRP1 ug MFN1/2 parehong GTPases, busa ang kalihokan mahimong maimpluwensyahan sa gikusgon sa produksiyon sa GTP sa mitochondria 66. Busa, bisan kung ang ekspresyon niini nga mga protina nagpabilin nga makanunayon, kini mahimong dili magpakita sa wala mausab nga kalihokan sa protina o lokalisasyon67,68. Sa tinuud, ang kasamtangan nga mga repertoire sa protina sa PTM kanunay nga nagsilbing unang linya sa depensa nga responsable sa pag-mediate sa mga tubag sa mahait nga stress. Sa presensya sa kasarangan nga metabolic stress sa among modelo, lagmit nga ang PTM nagpasiugda sa dugang nga kalihokan sa mga protina sa fusion ug fission aron igo nga mapasig-uli ang integridad sa mitochondrial nga dili kinahanglan ang dugang nga pagpaaktibo niini nga mga gene sa lebel sa mRNA o protina.
Kon tan-awon sa kinatibuk-an, ang nahisgutang datos nagpasiugda sa komplikado ug nagsalig sa oras nga regulasyon sa mitochondrial morphology ug sa mga hagit sa pagpatin-aw niini nga mga mekanismo. Aron tun-an ang gene expression, kinahanglan una nga mailhan ang piho nga mga target gene sa pathway. Bisan pa, ang among datos nagpakita nga ang mga gene sa parehas nga pathway dili motubag sa parehas nga paagi sa parehas nga stress. Sa tinuud, ang nangaging mga pagtuon nagpakita nga ang lainlaing mga gene sa parehas nga pathway mahimong magpakita sa lainlaing mga temporal nga profile sa tubag30,46. Dugang pa, adunay mga komplikado nga post-transcriptional nga mekanismo nga makabalda sa relasyon tali sa transcription ug gene function. Ang mga pagtuon sa proteomic makahatag og panabut sa epekto sa mga PTM ug protein function, apan kini usab adunay mga hagit lakip ang mga pamaagi nga ubos ang throughput, taas nga signal-to-noise ratios, ug dili maayo nga resolusyon.
Niini nga konteksto, ang pagtuon sa mitochondrial morphology gamit ang TEM ug MEL adunay dakong potensyal sa pagtubag sa mga sukaranang pangutana bahin sa relasyon tali sa mitochondrial dynamics ug function ug kung giunsa kini makaimpluwensya sa sakit. Labing importante, ang TEM naghatag ug direktang pamaagi alang sa pagsukod sa mitochondrial morphology isip usa ka convergent endpoint sa mitochondrial dysfunction ug dynamics51. Ang MEL naghatag usab ug direktang pamaagi alang sa pag-visualize sa mga panghitabo sa fission ug fusion sa usa ka three-dimensional cellular environment, nga nagtugot sa quantification sa dynamic mitochondrial remodeling bisan kung wala’y mga pagbag-o sa gene expression33. Dinhi among gipasiugda ang gamit sa mitochondrial imaging techniques sa secondary mitochondrial diseases. Kini nga mga sakit kasagarang gihulagway sa chronic mild metabolic stress nga gihulagway sa subtle remodeling sa mitochondrial networks imbes nga acute mitochondrial damage. Bisan pa, ang mitochondrial compensation nga gikinahanglan aron mapadayon ang mitosis ubos sa chronic stress adunay lawom nga functional consequences. Sa konteksto sa neuroscience, ang mas maayo nga pagsabot niining mga compensatory mechanism mahimong makahatag ug importanteng impormasyon bahin sa pleiotropic neuropathology nga nalangkit sa mitochondrial dysfunction.
Sa katapusan, ang among datos nagpasiugda sa gamit sa mga teknik sa imaging alang sa pagsabot sa mga sangputanan sa komplikado nga interaksyon tali sa gene expression, mga pagbag-o sa protina, ug kalihokan sa protina nga nagkontrol sa neuronal mitochondrial dynamics. Gigamit namo ang PPA aron pag-modelo sa mitochondrial dysfunction sa usa ka neuronal cell model aron makakuha og panabut sa mitochondrial component sa ASD. Ang mga SH-SY5Y cell nga gitambalan sa PPA nagpakita og mga pagbag-o sa mitochondrial morphology: ang mitochondria nahimong gamay ug lingin, ug ang mga cristae dili maayo ang pagkahubit kung naobserbahan sa TEM. Ang pag-analisa sa MEL nagpakita nga kini nga mga pagbag-o nahitabo dungan sa pagtaas sa mga panghitabo sa fission ug fusion aron mapadayon ang mitochondrial network isip tubag sa malumo nga metabolic stress. Dugang pa, ang PPA hinungdanon nga nakabalda sa transcriptional regulation sa mitochondrial metabolism ug homeostasis. Among giila ang cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ug OPA1 isip mga importanteng mitochondrial regulator nga nabalda sa stress sa PPA ug mahimong adunay papel sa pag-mediate sa mga pagbag-o nga gipahinabo sa PPA sa mitochondrial morphology ug function. Gikinahanglan ang umaabot nga mga pagtuon aron mas mailhan ang mga pagbag-o nga gipahinabo sa PPA sa gene expression ug kalihokan sa protina, localization, ug post-translational modifications. Gipasiugda sa among datos ang pagkakomplikado ug pagsalig sa mga mekanismo sa regulasyon nga nagpataliwala sa tubag sa stress sa mitochondrial ug gipakita ang gamit sa TEM ug uban pang mga teknik sa imaging alang sa mas naka-target nga mga pagtuon sa mekanismo.
Ang SH-SY5Y cell line (ECACC, 94030304-1VL) gipalit gikan sa Sigma-Aldrich. Ang mga SH-SY5Y cell gipatubo sa Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 nutrient mixture (DMEM/F-12) ug L-glutamine (SC09411, ScienCell) sa 25 cm2 flasks nga gidugangan og 20% ​​fetal bovine serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ug 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) sa 37 °C, 5% CO2. Ang mga cell gi-subculture ngadto sa 80% nga confluence gamit ang 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), gi-centrifuge sa 300 g ug gi-plate sa density nga gibana-bana nga 7 × 105 cells/ml. Ang tanang eksperimento gihimo sa mga undifferentiated SH-SY5Y cells tali sa mga passage 19–22. Ang PPA gihatag isip NaP. Tunawa ang NaP powder (CAS No. 137-40-6, chemical formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) sa init nga MilliQ nga tubig ngadto sa konsentrasyon nga 1 M ug tipigi sa 4 °C. Sa adlaw sa pagtambal, tunawi kini nga solusyon gamit ang 1 M PPA ngadto sa 3 mM ug 5 mM PPA sa serum-free medium (DMEM/F-12 nga adunay L-glutamine). Ang mga konsentrasyon sa pagtambal alang sa tanang eksperimento walay PPA (0 mM, control), 3 mM, ug 5 mM PPA. Ang mga eksperimento gihimo sa labing menos tulo ka biological replicates.
Ang mga SH-SY5Y cells gipugas ngadto sa 25 cm5 flasks sa rate nga 5.5 × 105 cells/ml ug gipatubo sulod sa 24 oras. Ang PPA treatment gidugang sa flask sa dili pa ang 24 oras nga incubation. Kolektaha ang mga cell pellets pinaagi sa pagsunod sa normal nga mammalian tissue subculture protocols (gihulagway sa ibabaw). I-suspend pag-usab ang cell pellet sa 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS ug tipigi sa 4 °C hangtod maproseso. Ang mga SH-SY5Y cells gi-centrifuge sa makadiyot aron ma-pellet ang mga cells ug makuha ang 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS solution. I-suspend pag-usab ang sediment sa 4% agarose gel nga giandam sa distilled water (ang ratio sa agarose ngadto sa sediment volume kay 1:1). Ang mga piraso sa agarose gibutang sa mga grids sa patag nga mga plato ug gitabonan og 1-hexadecene sa dili pa ang high-pressure freezing. Ang mga sample gi-freeze sa 100% dry acetone sa -90°C sulod sa 24 oras. Ang temperatura gipataas dayon ngadto sa -80°C ug usa ka solusyon sa 1% osmium tetroxide ug 0.1% glutaraldehyde ang gidugang. Ang mga sample gitipigan sa -80°C sulod sa 24 oras. Pagkahuman niini, ang temperatura hinay-hinay nga gipataas ngadto sa temperatura sa kwarto sulod sa pipila ka adlaw: gikan sa – 80 °C ngadto sa – 50 °C sulod sa 24 oras, ngadto sa – 30 °C sulod sa 24 oras, ngadto sa – 10 °C sulod sa 24 oras ug sa katapusan ngadto sa temperatura sa kwarto.
Human sa cryogenic preparation, ang mga sample gi-impregnate og resin ug ang ultrathin nga mga seksyon (∼100 nm) gihimo gamit ang Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems). Ang mga seksyon gi-stain og 2% uranyl acetate ug lead citrate. Ang mga sample giobserbahan gamit ang FEI Tecnai 20 transmission electron microscope (ThermoFisher (kanhi FEI), Eindhoven, The Netherlands) nga nag-operate sa 200 kV (Lab6 transmitter) ug usa ka Gatan CCD camera (Gatan, UK) nga adunay Tridiem energy filter.
Sa matag teknikal nga replika, labing menos 24 ka single cell nga mga imahe ang nakuha, para sa kinatibuk-an nga 266 ka mga imahe. Ang tanang mga imahe gisusi gamit ang Region of Interest (ROI) macro ug ang Mitochondria macro. Ang mitochondrial macro gibase sa gipatik nga mga pamaagi17,31,32 ug nagtugot sa semi-automated batch processing sa mga TEM nga imahe sa Fiji/ImageJ69. Sa laktod nga pagkasulti: ang imahe gibaliktad ug gibaliktad gamit ang rolling ball background subtraction (60 pixel radius) ug usa ka FFT bandpass filter (gamit ang 60 ug 8 pixel upper ug lower bounds matag usa) ug vertical line suppression nga adunay orientation tolerance nga 5%. Ang giproseso nga imahe awtomatikong gi-threshold gamit ang maximum entropy algorithm ug usa ka binary mask ang gihimo. Ang mga rehiyon sa imahe nga nalangkit sa mano-mano nga gipili nga mga ROI sa hilaw nga mga imahe sa TEM gi-extract, nga nagpaila sa mitochondria ug wala gilakip ang plasma membrane ug uban pang mga rehiyon nga taas og contrast. Alang sa matag nakuha nga ROI, ang mga binary particle nga mas dako pa sa 600 ka pixel gi-analisa, ug ang particle area, perimeter, major ug minor axes, Feret diameter, roundness, ug circularity gisukod gamit ang built-in measurement functions sa Fiji/ImageJ. Human sa Merrill, Flippo, ug Strack (2017), ang area 2, particle aspect ratio (major to minor axis ratio), ug shape factor (FF) gikalkulo gikan niini nga datos, diin ang FF = perimeter 2/4pi x area. Ang depinisyon sa parametric formula makita sa Merrill, Flippo, ug Strack (2017). Ang mga macro nga gihisgutan anaa sa GitHub (tan-awa ang Data Availability Statement). Sa aberids, gibana-bana nga 5,600 ka particle ang gi-analisa matag PPA treatment, para sa kinatibuk-an nga gibana-bana nga 17,000 ka particle (wala gipakita ang datos).
Ang mga SH-SH5Y cell gibutang sa 8-chamber culture dishes (ThermoFisher, #155411) aron motapot ang kolor sa tibuok gabii ug dayon gi-incubate gamit ang TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ug Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Ang mga imahe nakuha gamit ang 405 nm ug 561 nm lasers sulod sa 10 minutos nga palibot, ug ang hilaw nga mga imahe nakuha isip z-stacks nga adunay 10 ka image micrographs nga adunay az step nga 0.2 μm tali sa mga image frame sa 12 ka sunod-sunod nga time points. Ang mga imahe gikolekta gamit ang Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-resolution platform (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) gamit ang LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lens. Ang mga imahe gisusi sa ImageJ gamit ang naunang gihulagway nga pipeline ug ang ImageJ plugin aron masukod ang mga panghitabo sa fusion ug fission, aberids nga gidaghanon sa mga istruktura sa mitochondrial, ug aberids nga gidaghanon sa mitochondrial kada cell33. Ang mga MEL macro anaa sa GitHub (tan-awa ang Data Availability Statement).
Ang mga SH-SY5Y cells gipatubo sa unom ka well plates sa density nga 0.3 × 106 cells/mL sulod sa 24 oras sa wala pa ang treatment. Ang RNA gi-extract gamit ang Quick-RNA™ Miniprep protocol (ZR R1055, Zymo Research) nga adunay gamay nga mga pagbag-o: idugang ang 300 μl nga RNA lysis buffer sa matag well sa dili pa tangtangon ug i-lyse ang matag sample isip katapusang lakang gamit ang 30 μl nga DNase/RNase elution. -free nga tubig. Ang tanang sample gisusi ang gidaghanon ug kalidad gamit ang NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Ang total nga protina gikan sa cell lysates nakuha gamit ang 200 μl RIPA lysis buffer, ug ang konsentrasyon sa protina gi-quantify gamit ang Bradford protein assay70.
Ang cDNA synthesis gihimo gamit ang Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) sumala sa mga instruksyon sa tiggama nga adunay pipila ka mga pagbag-o. Ang cDNA gi-synthesize sa 20-μl nga mga reaksyon gamit ang 0.7 hangtod 1 μg sa kinatibuk-ang RNA. Ang mga primer gipili gikan sa mga naunang gipatik nga mga papel 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Table S1) ug ang mga kaubang probe gidisenyo gamit ang PrimerQuest tool gikan sa Integrated DNA Technologies. Ang tanan nga mga gene nga interesado gi-normalize sa nuclear B2M gene. Ang gene expression sa STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ug OPA1 gisukod pinaagi sa RT-qPCR. Ang master mix naglakip sa LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward ug reverse primers, cDNA, ug PCR-grade nga tubig aron moresulta sa katapusang volume nga 10 μL para sa matag reaksyon. Ang ekspresyon sa division ug fission genes (DRP1, MFN1/2) gisukod gamit ang TaqMan multiplex assays. Ang Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) gigamit sumala sa mga instruksyon sa tiggama nga adunay gagmay nga mga pagbag-o. Ang multiplex RT-qPCR master mix naglakip sa 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM forward ug reverse primers, 10 μM probe, cDNA, ug PCR-grade nga tubig, nga miresulta sa katapusang volume nga 20 μL para sa matag reaksyon. Ang RT-qPCR gihimo gamit ang Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serial number: R0618110). Ang mga kondisyon sa pag-cycle gipakita sa Table S1. Ang tanang cDNA samples gi-amplify sa triplicate ug usa ka standard curve ang gihimo gamit ang serye sa napulo ka pilo nga dilutions. Ang mga outliers sa triplicate samples nga adunay cycle threshold standard deviation (Ct) >0.5 gikuha gikan sa analysis aron masiguro ang data reproducibility30,72. Ang relative gene expression gikalkulo gamit ang 2-ΔΔCt79 nga pamaagi.
Ang mga sample sa protina (60 μg) gisagol sa Laemmli loading buffer sa 2:1 ratio ug gipadagan sa 12% nga walay kolor nga protein gel (Bio-Rad #1610184). Ang mga protina gibalhin ngadto sa PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane (#170-84156, Bio-Rad) gamit ang Trans-Blot Turbo system (#170-4155, Bio-Rad). Ang membrane gibabagan ug gi-incubate uban sa angay nga primary antibodies (OPA1, MFN1, MFN2, ug DRP1) (gi-dilute 1:1000) sulod sa 48 ka oras, gisundan sa incubation uban sa secondary antibodies (1:10,000) sulod sa 1 ka oras. Ang mga membrane gi-image dayon gamit ang Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) ug gi-record gamit ang Bio-Rad ChemiDoc MP system. Ang ImageLab version 6.1 gigamit para sa Western blot analysis. Ang orihinal nga gel ug blot gipakita sa Figure S1. Ang impormasyon sa antibody gihatag sa Table S2.
Ang mga data set gipresentar isip mean ug standard error sa mean (SEM) sa labing menos tulo ka independente nga mga sample. Ang mga data set gisulayan alang sa normality gamit ang Shapiro-Wilks test (gawas kon lahi ang giingon) sa dili pa i-assume ang Gaussian distribution ug parehas nga standard deviations ug ipadayon ang mga pag-analisa. Gawas pa sa pag-analisa sa data set gamit ang Fisher's MEL LSD (p < 0.05), one-way ANOVA (treatment vs. control mean), ug Dunnett's multiple comparison test aron mahibal-an ang significance (p < 0.05). Ang mga significant p values ​​​​gipakita sa graph isip *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Ang tanan nga statistical analyses ug mga graph gihimo ug gihimo gamit ang GraphPad Prism 9.4.0.
Ang mga Fiji/ImageJ macro para sa TEM image analysis anaa sa publiko sa GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Ang Mitochondrial Event Locator (MEL) macro anaa sa publiko sa GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ug Vijaya A. Mitochondria: mga master regulator sa metabolismo, homeostasis, stress, pagkatigulang ug epigenetics. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Multifaceted mitochondrial dysfunction sa schizophrenia, complex I isip posibleng pathological target. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. ug Beal, MF Mitochondrial dysfunction sa Parkinson's disease. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ug Mehta V. Gi-stress nga mitochondria: mga target sa pagsulong sa sakit nga Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF ug Ferreira GK Mitochondria ug ang utok: bioenergetics ug uban pa. Neurotoxins. kapanguhaan. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropic mitochondria: ang epekto sa mitochondria sa neuronal development ug sakit. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. ug Morais, VA Mitochondrial biogenesis sa mga neuron: unsaon ug asa. internasyonalidad. J. Mohr. ang siyensya. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. ug Zhao, J. Regulasyon sa dinamika sa mitochondrial sa mga mammal: mga oportunidad ug mga hagit. atubangan. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. ug Slack, RS Dinamika sa mitochondrial sa regulasyon sa neurogenesis: gikan sa nag-uswag nga utok hangtod sa hamtong nga pag-uswag. dinamiko. 247, 47–53 (2018).