Karon *Kasamtangang adres: Cologne 50931, Germany, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Ang neurodegeneration sa mga sakit sa mitochondrial giisip nga dili na mabalik tungod kay limitado ang metabolic plasticity sa mga neuron, apan ang epekto sa mitochondrial dysfunction sa cell autonomy sa neuronal metabolism sa lawas dili kaayo masabtan. Dinhi, among gipaila ang cell-specific proteome sa mga Purkinje neuron nga adunay progresibong kakulangan sa OXPHOS nga gipahinabo sa nabalda nga mitochondrial fusion dynamics. Among nakita nga ang mitochondrial dysfunction nagpahinabo sa usa ka dakong pagbag-o sa natad sa proteomics, nga sa katapusan misangpot sa sunod-sunod nga pagpaaktibo sa tukma nga mga programa sa metabolismo sa wala pa ang pagkamatay sa selula. Sa wala damha, among natino ang klaro nga induction sa pyruvate carboxylase (PCx) ug uban pang anti-aging enzymes nga nagdugang sa mga intermediate sa TCA cycle. Ang pagpugong sa PCx nagpalala sa oxidative stress ug neurodegeneration, nga nagpakita nga ang atherosclerosis adunay protective effect sa mga neuron nga kulang sa OXPHOS. Ang pagpahiuli sa mitochondrial fusion sa mga terminally degenerated neurons hingpit nga nagbaliktad niining mga metabolic characteristics, sa ingon mapugngan ang pagkamatay sa selula. Ang among mga nahibal-an nag-ila sa wala pa mailhi nga mga agianan nga naghatag og kalig-on sa mitochondrial dysfunction ug nagpakita nga ang neurodegeneration mahimong mabaliktad bisan sa ulahing mga yugto sa sakit.
Ang sentral nga papel sa mitochondria sa pagmintinar sa metabolismo sa enerhiya sa neuronal gipasiugda sa daghang mga sintomas sa neurological nga nalangkit sa mga sakit sa mitochondrial sa tawo. Kadaghanan niini nga mga sakit gipahinabo sa mga mutasyon sa gene nga nag-regulate sa ekspresyon sa mitochondrial gene (1, 2) o pagkaguba sa gene nga may kalabotan sa dinamika sa mitochondrial, nga dili direkta nga nakaapekto sa kalig-on sa mitochondrial DNA (mtDNA) (3, 4). Ang trabaho sa mga modelo sa hayop nagpakita nga agig tubag sa mitochondrial dysfunction sa mga tisyu sa palibot, ang konserbatibo nga mga agianan sa metabolismo (5-7) mahimong ma-aktibo, nga naghatag hinungdanon nga impormasyon alang sa lawom nga pagsabot sa pathogenesis niining mga komplikado nga sakit. Sa kasukwahi, ang atong pagsabot sa mga pagbag-o sa metabolismo sa piho nga mga tipo sa selula nga gipahinabo sa kinatibuk-ang kapakyasan sa produksiyon sa adenosine triphosphate (ATP) sa mitochondrial sa utok hinungdanon (8), nga nagpasiugda sa panginahanglan sa pag-ila sa mga therapeutic target nga magamit aron mapugngan o mapugngan ang sakit. Mapugngan ang neurodegeneration (9). Ang kakulang sa impormasyon mao ang kamatuoran nga ang mga selula sa nerbiyos kaylap nga giisip nga adunay limitado nga metabolic flexibility kung itandi sa mga tipo sa selula sa mga tisyu sa palibot (10). Tungod kay kini nga mga selula adunay hinungdanong papel sa pag-coordinate sa suplay sa mga metabolite ngadto sa mga neuron aron mapalambo ang synaptic transmission ug motubag sa mga kondisyon sa kadaot ug sakit, ang abilidad sa pagpahiangay sa metabolismo sa selula ngadto sa mahagitong mga kondisyon sa tisyu sa utok halos limitado lamang sa mga glial cell (11-14). Dugang pa, ang kinaiyanhong cellular heterogeneity sa tisyu sa utok nakababag sa pagtuon sa mga pagbag-o sa metabolismo nga mahitabo sa piho nga mga neuronal subgroup. Tungod niini, gamay ra ang nahibal-an bahin sa eksaktong mga sangputanan sa cellular ug metabolic sa mitochondrial dysfunction sa mga neuron.
Aron masabtan ang mga metabolic nga sangputanan sa mitochondrial dysfunction, among gi-isolate ang Purkinje neurons (PNs) sa lain-laing mga yugto sa neurodegeneration nga gipahinabo sa pagkaguba sa mitochondrial outer membrane fusion (Mfn2). Bisan tuod ang mga mutasyon sa Mfn2 sa mga tawo nalangkit sa usa ka porma sa hereditary motor sensory neuropathy nga nailhan nga Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), ang conditional destruction sa Mfn2 sa mga ilaga usa ka nailhan nga induction of oxidation Phosphorylation (OXPHOS) dysfunction method. Ang lain-laing mga neuronal subtypes (16-19) ug ang resulta nga neurodegenerative phenotype giubanan sa progresibong mga sintomas sa neurological, sama sa mga movement disorders (18, 19) o cerebellar ataxia (16). Pinaagi sa paggamit sa kombinasyon sa label-free quantitative (LFQ) proteomics, metabolomics, imaging, ug virological methods, among gipakita nga ang progresibong neurodegeneration kusganong nag-induce sa pyruvate carboxylase (PCx) ug uban pang mga hinungdan nga nalambigit sa arteriosclerosis sa PNs in vivo Ang ekspresyon sa mga enzyme. Aron mapamatud-an ang kalambigitan niini nga nakaplagan, among gipaubos ang ekspresyon sa PCx sa Mfn2-deficient PNs, ug nakita nga kini nga operasyon nagpalala sa oxidative stress ug nagpadali sa neurodegeneration, sa ingon nagpamatuod nga ang azoospermia naghatag sa cell death. Metabolic adaptability. Ang grabe nga ekspresyon sa MFN2 hingpit nga makaluwas sa terminal degeneration PN nga adunay grabe nga OXPHOS deficiency, daghang konsumo sa mitochondrial DNA, ug daw nabungkag nga mitochondrial network, nga dugang nga nagpasiugda nga kini nga porma sa neurodegeneration mahimo pa nga maulian sa advanced stage sa sakit sa dili pa mamatay ang cell.
Aron makita ang mitochondria sa Mfn2 knockout PNs, migamit mig usa ka strain sa ilaga nga nagtugot sa Cre-dependent mitochondria nga mo-target sa yellow fluorescent protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre expression ug gisusi ang mitochondrial morphology in vivo. Among nakita nga ang pagkaguba sa Mfn2 gene sa PNs mosangpot sa hinay-hinay nga pagbahin sa mitochondrial network (Figure S1A), ug ang pinakaunang pagbag-o nakit-an sa 3 ka semana nga edad. Sa kasukwahi, ang dakong pagkadaot sa PN cell layer, sama sa gipamatud-an sa pagkawala sa Calbindin immunostaining, wala magsugod hangtod sa 12 ka semana nga edad (Figure 1, A ug B). Ang time mismatch tali sa pinakaunang mga pagbag-o sa mitochondrial morphology ug ang makita nga pagsugod sa neuronal death nag-aghat kanamo sa pag-imbestiga sa mga pagbag-o sa metabolismo nga gipahinabo sa mitochondrial dysfunction sa wala pa ang cell death. Naghimo kami og fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based nga estratehiya aron i-isolate ang YFP (YFP+)-expressing PN (Figure 1C), ug sa control mice (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), dinhi tawgon nga CTRL (Figure S1B). Ang pag-optimize sa gating strategy base sa relative intensity sa YFP signal nagtugot kanamo sa pagputli sa YFP+ body (YFPhigh) sa mga PN gikan sa mga non-PN (YFPneg) (Figure S1B) o putative fluorescent axon/dendritic fragments (YFPlow; Figure S1D, wala), nga gikumpirma sa confocal microscope (Figure S1D, tuo). Aron mapamatud-an ang identidad sa classified population, nagpahigayon kami og LFQ proteomics ug dayon principal component analysis, ug nakit-an nga adunay klaro nga panagbulag tali sa mga YFPhigh ug YFPneg cells (Figure S1C). Ang mga selula sa YFPhigh nagpakita og net enrichment sa nailhan nga mga marker sa PN (ie Calb1, Pcp2, Grid2 ug Itpr3) (21, 22), apan walay enrichment sa mga protina nga kasagarang gipahayag sa mga neuron o uban pang mga tipo sa selula (Figure 1D)). Ang pagtandi tali sa mga sample sa giklasipikar nga mga selula sa YFPhigh nga nakolekta sa independente nga mga eksperimento nagpakita og correlation coefficient nga > 0.9, nga nagpakita sa maayong reproducibility tali sa mga biological replicate (Figure S1E). Sa katingbanan, kini nga datos nagpamatuod sa among plano alang sa acute ug specific isolation sa feasible PN. Tungod kay ang L7-cre driver system nga gigamit nag-induce sa mosaic recombination sa unang semana human sa pagpanganak (23), nagsugod kami sa pag-cull sa mga ilaga gikan sa CTRL ug conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Pagkolekta sa mga neuron. Human makompleto ang recombination, kini gitawag nga Mfn2cKO sa 4 ka semana nga edad. Isip katapusang punto, among gipili ang 8 ka semana nga edad kung ang PN layer wala pa mausab bisan pa sa klaro nga mitochondrial fragmentation (Figure 1B ug Figure S1A). Sa kinatibuk-an, among gi-quantify ang total nga 3013 ka protina, diin mga 22% niini gibase sa MitoCarta 2.0 annotation base sa mitochondrial proteome isip mitochondria (Figure 1E) (Figure 1E) (24). Ang differential gene expression analysis nga gihimo sa semana 8 nagpakita nga 10.5% lang sa tanang protina ang adunay dakong mga pagbag-o (Figure 1F ug Figure S1F), diin 195 ka protina ang gipaubos ug 120 ka protina ang gipataas (Figure 1F). Angayan nga matikdan nga ang "innovative pathway analysis" niini nga data set nagpakita nga ang lain-laing expressed genes kasagaran nahisakop sa usa ka restricted set sa specific metabolic pathways (Figure 1G). Makapainteres, bisan tuod ang pag-ubos sa mga pathway nga may kalabotan sa OXPHOS ug calcium signaling nagpamatuod sa pag-aghat sa mitochondrial dysfunction sa mga PN nga kulang sa fusion, ang ubang mga kategorya nga naglambigit sa metabolismo sa amino acid miusbaw pag-ayo, nga nahiuyon sa metabolismo nga mahitabo sa mitochondrial PNs. Ang Rewiring makanunayon.
(A) Representatibong confocal nga mga litrato sa cerebellar nga mga seksyon sa CTRL ug Mfn2cKO nga mga ilaga nga nagpakita sa progresibong pagkawala sa mga PN (calbindin, gray); ang mga nuclei gi-counterstain gamit ang DAPI. (B) Kwantipikasyon sa (A) (one-way analysis of variance, ***P<0.001; n = 4 ngadto sa 6 ka lingin gikan sa tulo ka ilaga). (C) Eksperimental nga workflow. (D) Heat map distribution sa mga marker nga espesipiko sa Purkinje (ibabaw) ug uban pang mga tipo sa selula (tunga). (E) Venn diagram nga nagpakita sa gidaghanon sa mga mitochondrial protein nga nailhan sa classified PN. (F) Volcano plot sa differentially expressed proteins sa Mfn2cKO neurons sa 8 ka semana (significance cut-off value nga 1.3). (G) Ang creativity pathway analysis nagpakita sa lima ka labing importante nga up-regulation (pula) ug down-regulation (asul) nga mga pathway sa Mfn2cKO PN nga giklasipikar nga 8 ka semana. Gipakita ang average expression level sa matag nakita nga protina. Grayscale heat map: gi-adjust nga P value. ns, dili importante.
Ang datos sa proteomics nagpakita nga ang ekspresyon sa protina sa mga complex I, III, ug IV hinayhinay nga mikunhod. Ang mga Complex I, III, ug IV tanan adunay mga importanteng mtDNA-encoded subunits, samtang ang complex II, nga nuclear-coded lamang, wala gyud maapektuhan (Figure 2A ug Figure S2A). . Subay sa mga resulta sa proteomics, ang immunohistochemistry sa mga seksyon sa cerebellar tissue nagpakita nga ang lebel sa subunit sa MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) sa complex IV sa PN hinayhinay nga mikunhod (Figure 2B). Ang mtDNA-encoded subunit nga Mtatp8 mikunhod pag-ayo (Figure S2A), samtang ang steady-state level sa nuclear-encoded ATP synthase subunit nagpabilin nga wala mausab, nga nahiuyon sa nailhan nga stable ATP synthase subassembly F1 complex kung ang ekspresyon sa mtDNA lig-on. Ang pagkaporma makanunayon. Interrupt (7). Ang ebalwasyon sa lebel sa mtDNA sa gi-sort nga Mfn2cKO PNs pinaagi sa real-time polymerase chain reaction (qPCR) nagpamatuod sa hinay-hinay nga pagkunhod sa gidaghanon sa kopya sa mtDNA. Kung itandi sa control group, sa edad nga 8 ka semana, mga 20% ra sa lebel sa mtDNA ang nabilin (Figure 2C). Subay niini nga mga resulta, ang confocal microscopy staining sa Mfn2cKO PNs gigamit aron makit-an ang DNA, nga nagpakita sa time-dependent nga pagkonsumo sa mitochondrial nucleotides (Figure 2D). Among nakita nga pipila ra ka mga kandidato nga nalambigit sa mitochondrial protein degradation ug stress response ang na-up-regulate, lakip ang Lonp1, Afg3l2 ug Clpx, ug OXPHOS complex assembly factors. Walay nakitang dakong kausaban sa lebel sa mga protina nga nalambigit sa apoptosis (Figure S2B). Sa susama, among nakita nga ang mitochondria ug endoplasmic reticulum channels nga nalambigit sa calcium transport adunay gagmay ra nga mga kausaban (Figure S2C). Dugang pa, ang ebalwasyon sa mga protina nga may kalabutan sa autophagy wala’y nakit-an nga hinungdanon nga mga pagbag-o, nga nahiuyon sa makita nga induction sa mga autophagosome nga naobserbahan in vivo pinaagi sa immunohistochemistry ug electron microscopy (Figure S3). Bisan pa, ang progresibo nga OXPHOS dysfunction sa mga PN giubanan sa klaro nga ultrastructural nga mga pagbag-o sa mitochondrial. Makita ang mga mitochondrial cluster sa mga cell body ug dendritic tree sa Mfn2cKO PN nga nag-edad og 5 ug 8 ka semana, ug ang istruktura sa sulod nga lamad nakaagi og dakong mga pagbag-o (Figure S4, A ug B). Nahiuyon niining mga pagbag-o sa ultrastructural ug usa ka hinungdanon nga pagkunhod sa mtDNA, ang pag-analisar sa acute cerebral cerebellar slices nga adunay tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) nagpakita nga ang mitochondrial membrane potential sa Mfn2cKO PNs mikunhod pag-ayo (Figure S4C).
(A) Pag-analisa sa kurso sa oras sa lebel sa ekspresyon sa OXPHOS complex. Hunahunaa lamang ang mga protina nga adunay P<0.05 sa 8 ka semana (two-way ANOVA). Tuldok-tuldok nga linya: Walay pag-adjust kon itandi sa CTRL. (B) Wala: Usa ka ehemplo sa usa ka cerebellar section nga gimarkahan og anti-MTCO1 antibody (scale bar, 20 μm). Ang lugar nga giokupar sa mga lawas sa selula sa Purkinje gitabonan sa dilaw. Tuo: Kwantipikasyon sa mga lebel sa MTCO1 (one-way analysis of variance; n = 7 hangtod 20 ka mga selula nga gisusi gikan sa tulo ka mga ilaga). (C) qPCR analysis sa mtDNA copy number sa sorted PN (one-way analysis of variance; n = 3 hangtod 7 ka mga ilaga). (D) Wala: Usa ka ehemplo sa usa ka cerebellar slice nga gimarkahan og anti-DNA antibody (scale bar, 20 μm). Ang lugar nga giokupar sa mga lawas sa selula sa Purkinje gitabonan sa dilaw. Tuo: Kwantipikasyon sa mga lesyon sa mtDNA (one-way analysis of variance; n = 5 hangtod 9 ka mga selula gikan sa tulo ka mga ilaga). (E) Usa ka ehemplo sa usa ka acute cerebellar section nga nagpakita sa mitoYFP + Purkinje cells (pana) sa usa ka whole-cell patch clamp recording. (F) Kwantipikasyon sa IV curve. (G) Representative recordings sa depolarizing current injection sa CTRL ug Mfn2cKO Purkinje cells. Top trace: Ang unang pulse nga nag-trigger sa AP. Bottom trace: Maximum AP frequency. (H) Kwantipikasyon sa postsynaptic spontaneous inputs (sPSPs). Ang representative recording trace ug ang zoom ratio niini gipakita sa (I). One-way analysis of variance nga gi-analisa ang n = 5 ngadto sa 20 ka cells gikan sa tulo ka ilaga. Ang datos gipahayag isip mean±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Representative traces sa spontaneous AP nga na-record gamit ang perforated patch clamp mode. Top trace: Maximum AP frequency. Bottom trace: zoom sa usa ka AP. (K) Kwantipikasyon sa average ug maximum AP frequency sumala sa (J). Mann-Whitney test; n = 5 ka cells ang gi-analisa gikan sa upat ka ilaga. Ang datos gipahayag isip mean ± SEM; dili importante.
Klaro nga nakita ang kadaot sa OXPHOS sa 8-ka-semana nga Mfn2cKO PN, nga nagpakita nga ang pisyolohikal nga gimbuhaton sa mga neuron grabe nga dili normal. Busa, among gisusi ang passive electrical characteristics sa mga neuron nga kulang sa OXPHOS sa 4 hangtod 5 ka semana ug 7 hangtod 8 ka semana pinaagi sa paghimo og whole-cell patch clamp recordings sa acute cerebellar slices (Figure 2E). Wala damha, ang average resting membrane potential ug input resistance sa mga Mfn2cKO neuron parehas sa control, bisan kung adunay gamay nga kalainan tali sa mga selula (Table 1). Sa susama, sa 4 hangtod 5 ka semana nga edad, walay nakit-an nga hinungdanon nga mga pagbag-o sa relasyon sa current-voltage (IV curve) (Figure 2F). Bisan pa, walay mga Mfn2cKO neuron nga 7 hangtod 8 ka semana ang edad nga nakalahutay sa IV regimen (hyperpolarization step), nga nagpakita nga adunay klaro nga pagkasensitibo sa hyperpolarization potential niining ulahing yugto. Sa kasukwahi, sa mga neuron sa Mfn2cKO, ang mga depolarizing currents nga hinungdan sa balik-balik nga action potential (AP) discharges maayo nga gitugot, nga nagpakita nga ang ilang kinatibuk-ang mga sumbanan sa discharge dili kaayo lahi sa mga 8-ka-semana nga control neuron (Table 1 ug Figure 2G). Sa susama, ang frequency ug amplitude sa spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) parehas sa mga naa sa control group, ug ang frequency sa mga panghitabo misaka gikan sa 4 ka semana ngadto sa 5 ka semana ngadto sa 7 ka semana ngadto sa 8 ka semana nga adunay parehas nga pagtaas (Figure 2, H ug I). Ang panahon sa synaptic maturation sa mga PN (25). Parehas nga mga resulta ang nakuha pagkahuman sa mga perforated PNs patches. Kini nga configuration nagpugong sa posible nga pag-compensate sa mga depekto sa cellular ATP, sama sa mahimong mahitabo sa whole-cell patch clamp recording. Sa partikular, ang resting membrane potential ug spontaneous firing frequency sa mga neuron sa Mfn2cKO wala maapektuhan (Figure 2, J ug K). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagpakita nga ang mga PN nga adunay klaro nga OXPHOS dysfunction makasagubang pag-ayo sa mga high-frequency discharge pattern, nga nagpakita nga adunay mekanismo sa kompensasyon nga nagtugot kanila sa pagpadayon sa hapit normal nga mga tubag sa electrophysiological.
Ang datos gipahayag isip mean ± SEM (one-way analysis of variance, Holm-Sidak's multiple comparison test; *P<0.05). Ang unit number gipakita pinaagi sa mga bracket.
Among gisugdan ang pag-imbestiga kon aduna bay kategorya sa proteomics dataset (Figure 1G) nga naglakip sa mga agianan nga makasukol sa grabe nga kakulangan sa OXPHOS, nga nagpatin-aw kon nganong ang apektadong PN makapadayon sa halos normal nga electrophysiology (Figure 2, E to K). Ang pag-analisa sa proteomics nagpakita nga ang mga enzyme nga nalambigit sa catabolism sa branched chain amino acids (BCAA) miusbaw pag-ayo (Figure 3A ug Figure S5A), ug ang katapusang produkto nga acetyl-CoA (CoA) o succinyl CoA makadugang sa tricarboxylates sa arteriosclerosis Acid (TCA) cycle. Among nakita nga ang sulod sa BCAA transaminase 1 (BCAT1) ug BCAT2 parehong misaka. Kini ang nag-catalyze sa unang lakang sa BCAA catabolism pinaagi sa pagmugna og glutamate gikan sa α-ketoglutarate (26). Ang tanang subunit nga naglangkob sa branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) complex gi-upregulate (ang complex nag-catalyze sa sunod ug dili na mabalik nga decarboxylation sa resulta nga BCAA carbon skeleton) (Figure 3A ug Figure S5A). Bisan pa, walay klaro nga mga pagbag-o sa BCAA mismo ang nakit-an sa sorted PN, nga mahimong tungod sa dugang nga cellular uptake niining mga essential amino acid o sa paggamit sa ubang mga tinubdan (glucose o lactic acid) aron madugangan ang TCA cycle (Figure S5B). Ang mga PN nga kulang sa OXPHOS nagpakita usab og dugang nga glutamine decomposition ug transamination activities sa 8 ka semana nga edad, nga makita sa up-regulation sa mitochondrial enzymes glutaminase (GLS) ug glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figure 3, A ug C). Angayan nga matikdan nga ang pag-usbaw sa GLS limitado lamang sa spliced ​​​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (ang pagbag-o sa Mfn2cKO/CTRL gibana-bana nga 4.5 ka pilo, P = 0.05), ug ang piho nga pag-usbaw niini sa mga tisyu sa kanser makasuporta sa mitochondrial bioenergy. (27).
(A) Ang heat map nagpakita sa pagbag-o sa lebel sa protina alang sa gitakdang ruta sa 8 ka semana. (B) Pananglitan sa usa ka cerebellar slice nga gimarkahan og anti-PCx antibody (scale bar, 20 μm). Ang dalag nga pana nagtudlo sa Purkinje cell body. (C) Pag-analisar sa ekspresyon sa protina sa time course nga giila nga usa ka importanteng kandidato alang sa atherosclerosis (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 ka ilaga). (D) Sa ibabaw: Usa ka eskematiko nga diagram nga nagpakita sa lainlaing mga paagi sa pagsulod sa gimarkahan nga carbon nga anaa sa [1-13C]pyruvate tracer (ie, pinaagi sa PDH o trans-arterial route). Ubos: Ang tsart sa violin nagpakita sa porsyento sa single-labeled carbon (M1) nga nakabig ngadto sa aspartic acid, citric acid ug malic acid human sa pag-label sa acute cerebellar slices gamit ang [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01). (E) Komprehensibo nga pag-analisar sa kasaysayan sa oras sa gipakita nga agianan. Hunahunaa lamang ang mga protina nga adunay P<0.05 sa 8 ka semana. Putol-putol nga linya: walay bili sa pag-adjust (two-way analysis of variance; * P <0.05; *** P <0.001). Ang datos gipahayag isip mean±SEM.
Sa among pag-analisar, ang BCAA catabolism nahimong usa sa mga nag-unang agianan sa pag-usbaw sa regulasyon. Kini nga kamatuoran kusganong nagsugyot nga ang gidaghanon sa bentilasyon nga mosulod sa siklo sa TCA mahimong mausab sa PN nga kulang sa OXPHOS. Kini mahimong usa ka mayor nga porma sa neuronal metabolic rewiring, nga mahimong adunay direktang epekto sa neuronal physiology ug survival atol sa pagmentinar sa grabe nga OXPHOS dysfunction. Nahiuyon niini nga hypothesis, among nakita nga ang pangunang anti-atherosclerotic enzyme nga PCx na-up-regulate (Ang Mfn2cKO/CTRL mausab og gibana-bana nga 1.5 ka beses; Figure 3A), nga nag-catalyze sa pagkakabig sa pyruvate ngadto sa oxaloacetate (28), nga gituohan nga anaa sa tisyu sa utok. Ang ekspresyon sa limitado sa mga astrocytes (29, 30). Nahiuyon sa mga resulta sa proteomics, ang confocal microscopy nagpakita nga ang ekspresyon sa PCx espesipiko ug hinungdanon nga nadugangan sa mga PN nga kulang sa OXPHOS, samtang ang reaktibidad sa PCx labi nga limitado sa kasikbit nga mga selula sa glial nga Bergmann sa kontrol (Figure 3B). Aron masulayan ang naobserbahan nga pag-usbaw sa PCx, among gitambalan ang acute cerebellar slices gamit ang [1-13C]pyruvate tracer. Sa dihang ang pyruvate gi-oxidize sa pyruvate dehydrogenase (PDH), ang isotope label niini nawala, apan gilakip sa TCA cycle intermediates sa dihang ang pyruvate gi-metabolize pinaagi sa vascular reactions (Figure 3D). Agig suporta sa among proteomics data, among naobserbahan ang daghang mga marker gikan niini nga tracer sa aspartic acid sa Mfn2cKO slices, samtang ang citric acid ug malic acid adunay kasarangan usab nga trend, bisan dili significant (Figure 3D).
Sa mga dopamine neuron sa mga ilaga nga MitoPark nga adunay mitochondrial dysfunction nga gipahinabo sa mga dopamine neuron nga espesipikong nagguba sa mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) (Figure S6B), ang ekspresyon sa PCx miusbaw usab pag-ayo (31), nga nagpakita nga ang pagkahitabo sa sakit gi-regulate atol sa pagka-disfunction sa neuronal OXPHOS sa lawas. Angayan nga matikdan nga nakit-an nga ang talagsaon nga mga enzyme (32-34) nga mahimong ipahayag sa mga neuron nga mahimong nalangkit sa arteriosclerosis miusbaw pag-ayo sa mga PN nga kulang sa OXPHOS, sama sa propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), ang Malonyl-CoA nag-convert sa propionyl-CoA ngadto sa succinyl-CoA ug mitochondrial malic enzyme 3 (ME3), kansang pangunang papel mao ang pagbawi sa pyruvate gikan sa malate (Figure 3, A ug C) (33, 35). Dugang pa, nakakita kami og dakong pagtaas sa Pdk3 enzyme, nga nag-phosphorylate ug busa nag-inactivate sa PDH (36), samtang walay nakitang mga pagbag-o sa Pdp1 enzyme nga nag-activate sa PDH o sa PDH enzyme complex mismo (Figure 3A). Kanunay, sa Mern2cKO PNs, ang phosphorylation sa α1 subunit α (PDHE1α) subunit sa pyruvate dehydrogenase E1 component sa PDH complex sa Ser293 (nailhan nga nagpugong sa enzyme activity sa PDH) nadugangan (Figure S6C) (Figure S6C). Ang Pyruvate walay vascular access.
Sa katapusan, among nakita nga ang super pathway sa serine ug glycine biosynthesis, ang may kalabutan nga mitochondrial folate (1C) cycle ug proline biosynthesis (Figure 1G ug Figure S5C) tanan dako og up-regulate, sumala sa mga report, atol sa proseso sa pagpaaktibo. Ang mga tisyu sa palibot gi-activate nga adunay mitochondrial dysfunction (5-7). Ang confocal analysis nga nagsuporta niining datos sa proteomics nagpakita nga sa PN nga nawala ang OXPHOS, ang cerebellar slices sa 8 ka semana nga mga ilaga gipailalom sa serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), usa ka importanteng enzyme sa mitochondrial folate cycle. Dako ang immune response (Figure S5D). Sa 13 ka CU-glucose-incubated acute cerebellar slices, ang metabolic tracing experiments dugang nga nagpamatuod sa up-regulation sa serine ug proline biosynthesis, nga nagpakita nga ang flux sa carbon isoforms ngadto sa serine ug proline misaka (Figure S5E). Tungod kay ang mga reaksyon nga gipasiugdahan sa GLS ug GPT2 mao ang responsable sa sintesis sa glutamate gikan sa glutamine ug ang transamination tali sa glutamate ug α-ketoglutarate, ang ilang upregulation nagpakita nga ang mga neuron nga kulang sa OXPHOS adunay dugang nga panginahanglan alang sa glutamate, kini mahimong gitumong sa pagmintinar sa dugang nga biosynthesis sa proline (Figure S5C). Sukwahi niini nga mga pagbag-o, ang usa ka proteomic analysis sa cerebellar astrocytes gikan sa PN-specific Mfn2cKO nga mga ilaga nagpakita nga kini nga mga pathway (lakip ang tanan nga antiperoxidases) wala kaayo mausab sa ekspresyon, sa ingon nagpakita nga kini nga metabolic redirection selective sa degraded PN (Fig. S6, D hangtod G).
Sa kinatibuk-an, kini nga mga pag-analisa nagpadayag ug managlahi nga mga sumbanan sa temporal nga pagpaaktibo sa piho nga mga metabolic pathway sa PNs. Bisan kung ang abnormal nga neuronal mitochondrial function mahimong mosangpot sa sayo nga atherosclerosis ug 1C remodeling (Figure 3E ug Figure S5C), ug bisan sa matag-an nga mga pagbag-o sa ekspresyon sa I ug IV complexes, ang mga pagbag-o sa serine de novo synthesis makita lamang sa ulahing mga yugto. Kini nga mga nahibal-an naghubit sa usa ka sunod-sunod nga proseso diin ang stress-induced mitochondrial (1C cycle) ug cytoplasmic (serine biosynthesis) motubag nga sinergistiko sa pagtaas sa atherosclerosis sa TCA cycle aron mabag-o ang neuronal metabolism.
Ang 8-ka-semana nga OXPHOS-deficient PNs makapadayon sa high-frequency excitation activity ug makaagi og significant metabolic reconnection aron mabayran ang mitochondrial dysfunction. Kini nga nadiskobrehan nagpatungha og usa ka makapainteres nga posibilidad nga bisan niining higayona, kini nga mga selula mahimo usab nga makadawat og therapeutic intervention aron malangan o mapugngan ang neurodegeneration. Ulahi na. Among nasulbad kini nga posibilidad pinaagi sa duha ka independente nga mga interbensyon. Sa unang pamaagi, among gidisenyo ang usa ka Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector aron ang MFN2 mahimong mapili nga ipahayag sa OXPHOS-deficient PNs in vivo (Figure S7A). Ang AAV encoding MFN2 ug ang fluorescent reporter gene mCherry (Mfn2-AAV) gipamatud-an sa primary neuron cultures in vitro, nga hinungdan sa MFN2 nga ipahayag sa usa ka Cre-dependent nga paagi ug naluwas ang mitochondrial morphology, sa ingon mapugngan ang neuromutation sa Mfn2cKO neurons (Figure S7, B, D ug E). Sunod, nagpahigayon kami og mga eksperimento sa in vivo aron stereotactically nga ihatud ang 8-ka-semana nga Mfn2-AAV ngadto sa cerebellar cortex sa Mfn2cKO ug control nga mga ilaga, ug gi-analisar ang 12-ka-semana nga mga ilaga (Figure 4A). Ang gitambalan nga Mfn2cKO nga mga ilaga namatay (Figure 1, A ug B) (16). Ang viral transduction in vivo miresulta sa selective expression sa PN sa pipila ka cerebellar circles (Figure S7, G ug H). Ang injection sa control AAV nga nagpahayag lamang sa mCherry (Ctrl-AAV) walay dakong epekto sa degree sa neurodegeneration sa mga hayop nga Mfn2cKO. Sa kasukwahi, ang pag-analisar sa Mfn2cKOs nga gi-transduce gamit ang Mfn2-AAV nagpakita og dakong protective effect sa PN cell layer (Figure 4, B ug C). Sa partikular, ang neuron density daw halos dili mailhan gikan sa control nga mga hayop (Figure 4, B ug C, ug Figure S7, H ug I). Ang ekspresyon sa MFN1 apan dili ang MFN2 parehas nga epektibo sa pagluwas sa neuronal death (Figure 4C ug Figure S7, C ug F), nga nagpakita nga ang ekspresyon sa ectopic MFN1 epektibong makapuno sa kakulang sa MFN2. Ang dugang nga pag-analisar sa single PN level nagpakita nga ang Mfn2-AAV dako nga nakaluwas sa ultrastructure sa mitochondria, naka-normalize sa mtDNA levels, ug nakabaliktad sa taas nga ekspresyon sa anti-angiogenesis marker PCx ​​​​(Figure 4, C hangtod E). Ang biswal nga inspeksyon sa naluwas nga Mfn2cKO nga mga ilaga sa usa ka resting state nagpakita nga ang ilang postura ug mga sintomas sa motor (paglihok S1 hangtod S3) miuswag. Sa konklusyon, kini nga mga eksperimento nagpakita nga ang nalangan nga pagpaila pag-usab sa MFN2 ngadto sa mga PN nga grabe nga kulang sa OXPHOS igo na aron mabaliktad ang konsumo sa mtDNA ug maaghat ang atherosclerosis, sa ingon mapugngan ang axon degeneration ug neuronal death in vivo.
(A) Usa ka eskema nga nagpakita sa eksperimental nga iskedyul alang sa pag-inject sa AAV encoding MFN2 kung ang gipakita nga metabolic pathway gi-activate. (B) Representative confocal nga mga imahe sa 12-ka-semana nga edad nga cerebellar slices nga gi-transduce sa 8 ka semana sa Mfn2cKO nga mga ilaga ug gimarkahan og anti-Calbindin antibody. Tuo: Pag-scale sa mga axon fibers. Ang sukdanan sa axon zoom kay 450 ug 75 μm. (C) Wala: Pag-kwantipika sa Purkinje cell density sa AAV transduction loop (AAV+) (one-way analysis of variance; n = 3 ka ilaga). Tuo: mtDNA focus analysis sa transduced PN sa semana 12 (unpaired t-test; n = 6 ka mga selula gikan sa tulo ka mga ilaga). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Representative transmission electron micrographs sa PNs sa Mfn2cKO cerebellar sections nga gi-transduce uban sa gipakita nga viral vectors. Ang pink nga maskara nagpakita sa lugar nga giokupar sa mga dendrite, ug ang dalag nga tuldok-tuldok nga kwadro nagpakita sa zoom nga gihatag sa tuo; ang n nagrepresentar sa nucleus. Ang scale bar, 1μm. (E) nagpakita sa usa ka pananglitan sa PCx staining sa PN nga gi-transduce sa 12 ka semana. Scale bar, 20μm. OE, overexpression; FC, fold change.
Sa katapusan, among gisusi ang kamahinungdanon sa peroxidase-induced cell survival sa mga PN nga nakasinati og OXPHOS dysfunction. Naghimo kami og mCherry encoding nga AAV-shRNA (short hairpin RNA) nga espesipikong nagtumong sa mouse PCx mRNA (AAV-shPCx), ug gi-inject ang virus o ang scrambled control niini (AAV-scr) ngadto sa cerebellum sa Mfn2cKO nga mga ilaga. Ang injection gihimo sa ikaupat nga semana sa edad (Figure 5A) aron makab-ot ang epektibo nga PCx knockdown atol sa panahon nga ang PCx expression misaka (Figure 3C) ug ang PN cell layer wala pa madaot (Figure 1A). Angayan nga matikdan nga ang pag-knockdown sa PCx (Figure S8A) mosangpot sa usa ka dakong pagpadali sa PN death, nga limitado sa infected ring (Figure 5, B ug C). Aron masabtan ang mekanismo sa mga epekto sa metabolismo nga gipahinabo sa PCx up-regulation, among gitun-an ang redox status sa mga PN human ang PCx knockdown ug AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 dungan nga gi-express (Figure S8, B hangtod D) aron masusi ang glutathione Ang relatibong pagbag-o sa peptide redox potential (38). Dayon, naghimo kami og two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) sa acute brain slices sa 7-ka-semana nga Mfn2cKO o control littermates aron mahibal-an ang mga potensyal nga pagbag-o sa cytoplasmic redox status human mapamatud-an ang mga kondisyon sa FLIM (Figure S8, E hangtod G). Ang pag-analisa nagpakita og dakong pagtaas sa oxidation state sa usa ka Mfn2cKO PN nga kulang sa PCx expression, nga lahi sa control neurons o Mfn2cKO PNs nga nagpahayag lamang og scrambled shRNA (Figure 5, D ug E). Sa dihang gipaubos ang ekspresyon sa PCx, ang porsyento sa Mfn2cKO PNs nga nagpakita sa usa ka highly oxidized state misaka og sobra sa tulo ka pilo (Figure 5E), nga nagpakita nga ang PCx up-regulation nagmintinar sa redox capacity sa mga degenerated neurons.
(A) Usa ka eskema nga nagpakita sa iskedyul sa eksperimento alang sa pag-inject sa AAV encoding shPCx kung ang gipakita nga metabolic pathway ma-activate. (B) Representative confocal nga mga litrato sa 8-ka-semana nga cerebellar sections sa Mfn2cKO nga mga ilaga nga gi-transduce ug gi-label gamit ang anti-calcineurin antibody sa 4 ka semana. Scale bar, 450μm. (C) Kwantipikasyon sa Purkinje cell density sa AAV-transduced loops (one-way analysis of variance; n = 3 ngadto sa 4 ka ilaga). Ang datos gipahayag isip mean±SEM; ***P<0.001. (D) Ang representative nga hulagway sa FLIM nagpakita sa aberids nga gitas-on sa kinabuhi sa 7-ka-semana nga PN nga nagpahayag sa glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 ubos sa gitakdang mga kondisyon sa eksperimento. LUT (look-up table) ratio: survival time interval (sa picoseconds). Scale bar, 25μm. (E) Ang histogram nagpakita sa distribusyon sa mga lifetime value sa Grx1-roGFP2 gikan sa (D) (n=158 ngadto sa 368 ka mga selula sa duha ka ilaga ubos sa matag kondisyon). Ang pie chart sa ibabaw sa matag histogram: nagpakita sa gidaghanon sa mga selula nga adunay mas taas (pula, na-oxidize) o mas mubo (asul, gipakunhod) nga mga lifespan value, nga milapas sa 1 SD sa average lifespan value sa CTRL-AAV-scr. (F) Ang gisugyot nga modelo nagpakita sa protective effect sa upregulation sa neuronal PCx.
Sa kinatibuk-an, ang datos nga among gihatag dinhi nagpakita nga ang re-expression sa MFN2 hingpit nga makaluwas sa advanced PN nga adunay grabe nga kakulangan sa OXPHOS, grabe nga pagkunhod sa mtDNA, ug hilabihan ka abnormal nga ista-like morphology, sa ingon naghatag og padayon nga pag-uswag bisan sa mga advanced nga sakit. Ang neurodegeneration naghatag og mabaliktad nga ebidensya sa yugto sa wala pa ang pagkamatay sa cell. Kini nga lebel sa metabolic flexibility dugang nga gipasiugda sa abilidad sa mga neuron sa pag-induce sa atherosclerosis (usa ka pag-usab sa TCA cycle), nga nagpugong sa ekspresyon sa PCx sa mga PN nga kulang sa OXPHOS ug nagpalambo sa pagkamatay sa cell, sa ingon adunay papel sa pagpanalipod (Figure 5F).
Niini nga pagtuon, naghatag kami og ebidensya nga ang tubag sa mga PN sa OXPHOS dysfunction mao ang hinay-hinay nga pagtagbo sa TCA cycle atherosclerosis pinaagi sa differential activation pathway nga gi-activate sa metabolic programs. Gikumpirma namo ang proteomic analysis gamit ang daghang komplementaryong pamaagi ug gipadayag nga kung gihagit sa grabe nga mitochondrial dysfunction, ang mga neuron adunay wala pa mailhi nga porma sa metabolic elasticity. Sa among katingala, ang tibuuk nga proseso sa pag-rewiring dili kinahanglan nga magtimaan sa terminal metabolic state nga kauban sa neurodegeneration nga hinay-hinay ug dili na mabaliktad, apan ang among datos nagsugyot nga kini mahimo’g usa ka maintenance neuron bisan sa yugto sa wala pa ang pagkamatay sa cell Functional compensation mechanism. Kini nga nakaplagan nagpakita nga ang mga neuron adunay igo nga lebel sa metabolic plasticity sa lawas. Kini nga kamatuoran nagpamatuod nga ang ulahi nga pagpaila pag-usab sa MFN2 mahimong balihon ang ekspresyon sa mga hinungdanon nga metabolic marker ug mapugngan ang PN degeneration. Sa sukwahi, kini makapugong sa atherosclerosis ug makapadali sa mga nerbiyos. transsexual.
Usa sa labing makapainteres nga mga nadiskobrehan sa among panukiduki mao nga ang mga PN nga kulang sa OXPHOS makausab sa metabolismo sa siklo sa TCA pinaagi sa pag-up-regulating sa mga enzyme nga espesipikong makapadasig sa arteriosclerosis. Ang metabolic rearrangement usa ka komon nga bahin sa mga selula sa kanser, diin ang uban niini nagsalig sa glutamine aron madugangan ang mga intermediate sa siklo sa TCA aron makahimo og mga reducing equivalents, nga nagduso sa respiratory chain ug nagmintinar sa produksiyon sa lipid ug nucleotide biosynthesis precursors (39, 40). Usa ka bag-o nga pagtuon nagpakita nga sa mga peripheral tissue nga nakasinati og OXPHOS dysfunction, ang pagkonektar pag-usab sa metabolismo sa glutamine/glutamate usa usab ka prominenteng bahin (5, 41), diin ang direksyon sa pagsulod sa glutamine sa siklo sa TCA nagdepende sa kagrabe sa kadaot sa OXPHOS (41). Bisan pa, adunay kakulang sa klaro nga ebidensya sa bisan unsang pagkaparehas sa neuronal metabolic plasticity sa lawas ug ang posible nga kalabutan niini sa konteksto sa sakit. Sa usa ka bag-o nga in vitro nga pagtuon, ang mga primary cortical neuron gipakita nga nagpalihok sa mga glutamate pool alang sa neurotransmission, sa ingon nagpasiugda sa oxidative metabolism ug atherosclerosis ubos sa mga kondisyon sa metabolic stress (42). Angayan nga matikdan nga ubos sa pharmacological inhibition sa TCA cycle enzyme succinate dehydrogenase, ang pyruvate carboxylation gituohan nga nagmintinar sa synthesis sa oxaloacetate sa cultured cerebellar granule neurons (34). Bisan pa, ang physiological relevance niini nga mga mekanismo sa tisyu sa utok (diin ang atherosclerosis gituohan nga kasagaran limitado sa mga astrocytes) adunay gihapon importante nga physiological significance (43). Niini nga kaso, ang among datos nagpakita nga ang mga PN nga nadaot sa OXPHOS sa lawas mahimong ibalhin ngadto sa BCAA degradation ug pyruvate carboxylation, nga mao ang duha ka pangunang tinubdan sa supplementation sa TCA pool intermediates. Bisan tuod ang gituohan nga kontribusyon sa BCAA catabolism sa neuronal energy metabolism gisugyot, dugang pa sa papel sa glutamate ug GABA alang sa neurotransmission (44), wala gihapoy ebidensya alang niini nga mga mekanismo in vivo. Busa, dali ra ang pag-espekulasyon nga ang dysfunctional PNs awtomatikong maka-compensate sa konsumo sa TCA intermediates nga gimaneho sa proseso sa assimilation pinaagi sa pagdugang sa atherosclerosis. Ilabi na, ang pag-usbaw sa PCx mahimong gikinahanglan aron mapadayon ang dugang nga panginahanglan alang sa aspartic acid, nga gisugyot sa mga nagdaghan nga mga selula nga adunay mitochondrial dysfunction (45). Bisan pa, ang among metabolomics analysis wala magpadayag sa bisan unsang hinungdanon nga mga pagbag-o sa steady-state nga lebel sa aspartic acid sa Mfn2cKO PNs (Figure S6A), nga gituohan nga nagpakita sa lainlaing metabolic utilization sa aspartic acid taliwala sa nagdaghan nga mga selula ug post-mitotic neurons. Bisan kung ang eksaktong mekanismo sa pag-usbaw sa PCx sa mga dysfunctional neurons in vivo kinahanglan pa nga mailhan, among gipakita nga kini nga sayo nga tubag adunay hinungdanon nga papel sa pagmintinar sa redox state sa mga neuron, nga gipakita sa mga eksperimento sa FLIM sa mga cerebellar slices. Ilabi na, ang pagpugong sa mga PN gikan sa pag-usbaw sa PCx mahimong mosangpot sa usa ka mas oxidized nga estado ug pagpadali sa pagkamatay sa cell. Ang pagpaaktibo sa BCAA degradation ug ang carboxylation sa pyruvate dili mga paagi aron mailhan ang peripheral tissues sa mitochondrial dysfunction (7). Busa, kini daw usa ka prayoridad nga bahin sa mga neuron nga kulang sa OXPHOS, bisan kung dili lamang ang bahin, nga hinungdanon alang sa neurodegeneration. .
Ang sakit nga cerebellar usa ka heterogeneous nga klase sa sakit nga neurodegenerative nga kasagaran magpakita isip ataxia ug kanunay nga makadaot sa mga PN (46). Kini nga populasyon sa neuron labi nga huyang sa mitochondrial dysfunction tungod kay ang ilang selective degeneration sa mga ilaga igo na aron masubli ang daghang mga sintomas sa motor nga nagpaila sa spinocerebellar ataxia sa tawo (16, 47, 48). Sumala sa mga taho, ang usa ka transgenic mouse model nga adunay mutant gene nalangkit sa spinocerebellar ataxia sa tawo ug adunay mitochondrial dysfunction (49, 50), nga nagpasiugda sa kamahinungdanon sa pagtuon sa mga sangputanan sa kakulangan sa OXPHOS sa PNPH. Busa, labi nga angay nga epektibo nga ibulag ug tun-an kini nga talagsaon nga populasyon sa neuron. Bisan pa, tungod kay ang mga PN sensitibo kaayo sa presyur ug naglangkob sa gamay nga proporsyon sa tibuuk nga populasyon sa cerebellar cell, alang sa daghang mga pagtuon nga nakabase sa omics, ang selective separation niini isip tibuok nga mga selula usa gihapon ka mahagiton nga aspeto. Bisan tuod halos imposible nga makab-ot ang hingpit nga kakulang sa kontaminasyon sa ubang mga tipo sa selula (ilabi na ang mga tisyu sa hamtong), among gihiusa ang usa ka epektibo nga lakang sa dissociation uban sa FACS aron makakuha og igo nga gidaghanon sa mabuhi nga mga neuron alang sa downstream proteomics analysis, ug adunay taas nga protein coverage (mga 3000 ka protina) kon itandi sa kasamtangang data set sa tibuok cerebellum (51). Pinaagi sa pagpreserbar sa mabuhi nga tibuok nga mga selula, ang pamaagi nga among gihatag dinhi nagtugot kanamo dili lamang sa pagsusi sa mga pagbag-o sa metabolic pathways sa mitochondria, apan usab sa pagsusi sa mga pagbag-o sa mga cytoplasmic counterparts niini, nga nagkomplemento sa paggamit sa mitochondrial membrane tags aron mapauswag ang tipo sa selula. Ang bag-ong pamaagi alang sa gidaghanon sa mitochondria sa komplikado nga mga tisyu (52, 53). Ang pamaagi nga among gihulagway dili lamang may kalabutan sa pagtuon sa mga selula sa Purkinje, apan dali nga magamit sa bisan unsang klase sa selula aron matubag ang mga pagbag-o sa metabolismo sa mga utok nga adunay sakit, lakip ang ubang mga modelo sa mitochondrial dysfunction.
Sa katapusan, among nailhan ang usa ka therapeutic window atol niining metabolic rearrangement process nga hingpit nga makabaliktad sa mga importanteng timailhan sa cellular stress ug makapugong sa neuronal degeneration. Busa, ang pagsabot sa functional implikasyon sa rewiring nga gihulagway dinhi mahimong makahatag og sukaranang mga panabut sa posibleng mga pagtambal alang sa pagmintinar sa neuronal viability atol sa mitochondrial dysfunction. Ang umaabot nga panukiduki nga nagtumong sa pag-analisar sa mga pagbag-o sa metabolismo sa enerhiya sa ubang mga tipo sa selula sa utok gikinahanglan aron hingpit nga mapadayag ang pagka-aplikar niini nga prinsipyo sa ubang mga sakit sa neurological.
Ang mga ilaga nga MitoPark nahulagway na kaniadto (31). Ang mga ilaga nga C57BL/6N nga adunay loxP flanking Mfn2 genes nahulagway na kaniadto (18) ug gi-cross sa mga ilaga nga L7-Cre (23). Ang resulta nga double heterozygous progeny gi-cross dayon sa homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP nga mga ilaga aron makamugna og Purkinje-specific gene knockouts para sa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Sa usa ka subset sa pagpares, ang Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) gipaila pinaagi sa dugang nga mga crossing (20). Ang tanan nga mga pamaagi sa hayop gihimo subay sa mga giya sa Europa, nasyonal ug institusyonal ug giaprobahan sa LandesamtfürNatur sa Umwelt ug Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany. Ang trabaho sa hayop nagsunod usab sa giya sa European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Human sa anestesya sa cervical dislocation sa mabdos, ang embryo sa ilaga gi-isolate (E13). Ang cortex gi-dissect sa Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) nga gidugangan og 10 mM Hepes ug gipasa sa Dulbecco's Modified Eagle's Medium nga adunay papain (20 U/ml) ug cysteine ​​​​(1μg/ml). I-incubate ang tissue sa DMEM) ug i-dissociate kini pinaagi sa enzymatic digestion. Ml) sa 37°C sulod sa 20 minutos, ug dayon gi-mill sa DMEM nga gidugangan og 10% fetal bovine serum. Ang mga cell gi-seed sa mga glass coverslips nga gi-coat og polylysine sa density nga 2×106 kada 6 cm culture dish o sa density nga 0.5×105 cells/cm2 para sa imaging analysis. Human sa 4 ka oras, ang medium gipulihan sa Neurobasal serum-free medium nga adunay 1% B27 supplement ug 0.5 mM GlutaMax. Ang mga neuron gimentinar dayon sa 37°C ug 5% CO2 sa tibuok eksperimento, ug gipakaon kausa sa usa ka semana. Aron ma-induce ang recombination in vitro, 3μl (24-well culture dish) o 0.5μl (24-well plate) sa mosunod nga AAV9 virus vector ang gigamit sa pagtambal sa mga neuron sa ikaduhang adlaw in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, catalog number 105530-AAV9) ug AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catalog number 105545-AAV9).
Ang Mouse Mfn1 ug Mfn2 complementary DNA (nga nakuha gikan sa Addgene plasmid #23212 ug #23213, matag usa) gimarkahan sa V5 sequence (GKPIPNPLLGLDST) sa C-terminus, ug gihiusa sa mCherry sa frame pinaagi sa T2A sequence. Ang Grx1-roGFP2 usa ka gasa gikan sa Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Pinaagi sa pag-ilis sa tdTomato cassette gamit ang naandan nga mga pamaagi sa cloning, ang cassette gi-subclone ngadto sa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato backbone (Addgene reference number 28306) aron makamugna og pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ug pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vectors. Usa ka susamang estratehiya ang gigamit sa pagmugna sa control vector nga pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Aron makamugna sa AAV-shPCx construct, gikinahanglan ang usa ka plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), nga adunay sulod nga DNA sequence nga nag-encode sa shRNA nga nag-target sa mouse PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Ubos sa kontrol sa U6 promoter, ang mCherry gigamit ubos sa kontrol sa CMV promoter. Ang paghimo sa mga auxiliary AAV vectors gihimo sumala sa mga instruksyon sa tiggama (Cell Biolabs). Sa laktod nga pagkasulti, gamita ang transfer plasmid nga nagdala sa mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) nga transiently Transfection sa 293AAV cells-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) coding gene, ingon man ang coding sa AAV1 capsid protein ug accessory protein Packaging plasmid plasmid, gamit ang calcium phosphate method. Ang crude virus supernatant nakuha pinaagi sa freeze-thaw cycles sa dry ice/ethanol bath ug lysed cells sa phosphate buffered saline (PBS). Ang AAV vector giputli pinaagi sa discontinuous iodixanol gradient ultracentrifugation (24 oras sa 32,000 rpm ug 4°C) ug gi-concentrate gamit ang Amicon ultra-15 centrifugal filter. Ang genome titer sa AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX sama sa gihulagway kaniadto (54), gisukod pinaagi sa real-time quantitative PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ug AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Ang mga primary neuron gikiskis sa bugnaw kaayong 1x PBS, gi-pellet, ug dayon gi-homogenize sa 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer nga adunay phosphatase ug protease inhibitor (Roche). Ang protein quantification gihimo gamit ang bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific). Ang mga protina gibulag dayon pinaagi sa SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ug dayon gi-blot sa usa ka polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare). I-block ang mga non-specific sites ug i-incubate gamit ang primary antibody (tan-awa ang Table S1 para sa mga detalye) sa 5% nga gatas sa TBST (Tris-buffered saline with Tween), washing steps ug secondary antibody sa TBST Incubate. I-incubate gamit ang primary antibody sa tibuok gabii sa +4°C. Human sa paghugas, i-apply ang secondary antibody sulod sa 2 ka oras sa temperatura sa kwarto. Sunod, pinaagi sa pag-incubate sa parehas nga blot gamit ang anti-β-actin antibody, gikumpirma ang parehas nga loading. Pag-ila pinaagi sa pag-convert ngadto sa chemiluminescence ug pagpausbaw sa chemiluminescence (GE Healthcare).
Ang mga neuron nga kaniadto gipugas sa mga glass coverslip gi-fix gamit ang 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS sa gitakdang oras sa temperatura sa kwarto sulod sa 10 ka minuto. Ang mga coverslip unang gi-permeate sa 0.1% Triton X-100/PBS sulod sa 5 ka minuto sa temperatura sa kwarto, ug dayon sa blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Sa ikaduhang adlaw, ang mga coverslip gihugasan gamit ang blocking buffer ug gi-incubate sa angay nga fluorophore-conjugated secondary antibody sulod sa 2 ka oras sa temperatura sa kwarto; sa katapusan, ang mga sample gihugasan pag-ayo sa PBS nga adunay 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) nga gi-counterstain ug dayon gi-fix sa microscope slide nga adunay Aqua-Poly/Mount.
Ang mga ilaga (lalaki ug babaye) gi-anesthesia pinaagi sa intraperitoneal injection sa ketamine (130 mg/kg) ug xylazine (10 mg/kg) ug gihatag sa subcutaneous nga adunay carprofen analgesic (5 mg/kg). Ug gibutang sa usa ka stereotactic instrument (Kopf) nga adunay init nga pad. Ibutyag ang bagolbagol ug gamita ang dental drill aron nipison ang bahin sa cerebellar cortex nga katumbas sa mis bone (gikan sa lambda: ikog 1.8, lateral 1, nga katumbas sa lobules IV ug V). Gamita ang curved syringe needle aron maampingong maghimo og gamay nga lungag sa bagolbagol aron malikayan ang pagkabalda sa vasculature sa ubos. Dayon ang nipis nga drawn glass capillary hinayhinay nga gisulod sa micro-hole (gikan sa -1.3 ngadto sa -1 sa ventral nga bahin sa dura mater), ug 200 ngadto sa 300 nl AAV ang gi-inject sa micro-injector (Narishige) gamit ang manual syringes (Narishige) sa makadaghang higayon sa ubos nga pressure sulod sa 10 ngadto sa 20 minutos nga window. Human sa pag-infuse, ibutang ang capillary sulod sa laing 10 ka minuto aron ang virus hingpit nga mokatap. Human makuha ang mga capillary, ang panit gitahi pag-ayo aron maminusan ang panghubag sa samad ug tugotan ang hayop nga maulian. Ang mga hayop gitambalan og mga analgesic (caspofen) sulod sa pipila ka adlaw human sa operasyon, diin niining panahona ang ilang pisikal nga kondisyon gibantayan pag-ayo ug dayon sila gi-euthanize sa gitakdang oras. Ang tanan nga mga pamaagi gihimo subay sa mga giya sa Europa, nasyonal ug institusyonal ug giaprobahan sa LandesamtfürNatur sa Umwelt ug Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany.
Ang mga hayop gi-anesthesia gamit ang ketamine (100 mg/kg) ug xylazine (10 mg/kg), ug ang kasingkasing gi-perfuse una gamit ang 0.1 M PBS, ug dayon gamit ang 4% PFA sa PBS. Ang tisyu gi-dissect ug gi-fix sa 4% PFA/PBS tibuok gabii sa 4°C. Usa ka vibrating knife (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ang gigamit sa pag-andam sa sagittal sections (50 μm ang gibag-on) gikan sa fixed brain sa PBS. Gawas kon lahi ang giingon, ang pag-staining sa free-floating sections gihimo sama sa gihulagway sa ibabaw (13) sa temperatura sa kwarto ug pagkutaw. Sa laktod nga pagkasulti, una, ang nakuha nga mga hiwa gi-permeabilize gamit ang 0.5% Triton X-100/PBS sulod sa 15 minutos sa temperatura sa kwarto; para sa pipila ka epitopes (Pcx ug Shmt2), pinaagi sa in tris-EDTA buffer sa 80°C (PH 9) ipainit ang mga hiwa sulod sa 25 minutos imbes niini nga lakang. Sunod, ang mga seksyon gi-incubate uban sa primary antibody (tan-awa ang Table S1) sa blocking buffer (3% BSA/PBS) sa 4°C sa tibuok gabii uban ang pagkutaw. Pagkasunod adlaw, ang mga seksyon gihugasan gamit ang blocking buffer ug gi-incubate uban sa angay nga fluorophore-conjugated secondary antibody sulod sa 2 ka oras sa temperatura sa kwarto; sa katapusan, ang mga seksyon gihugasan pag-ayo sa PBS, gi-counter-stain gamit ang DAPI, ug dayon gi-fix gamit ang AquaPolymount sa usa ka microscope slide.
Usa ka laser scanning confocal microscope (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) nga adunay white light laser ug 405 diode ultraviolet laser ang gigamit sa pag-imahe sa sample. Pinaagi sa pag-excite sa fluorophore ug pagkolekta sa signal gamit ang Hybrid Detector (HyDs), gigamit ang LAS-X software sa pagkolekta sa mga stacked images nga nahiuyon sa Nyquist sampling sa sequential mode: para sa mga non-quantitative panel, kini highly dynamic signals (pananglitan, sa somatic cells ug dendrites) mtYFP) Gamita ang HyD aron ma-detect ang gidaghanon sa PNs sa BrightR mode). Ang gating gikan sa 0.3 ngadto sa 6 ns gigamit aron makunhuran ang background.
Real-time nga imaging sa mga na-sort nga selula. Human sa pag-sort sa Neurobasal-A medium nga adunay 1% B27 supplement ug 0.5 mM GlutaMax, ang mga selula gipugas dayon sa poly-l-lysine-coated glass slides (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826), Ug dayon ipadayon kini sa 37°C ug 5% CO2 sulod sa 1 ka oras aron mohusay ang mga selula. Ang real-time nga imaging gihimo sa usa ka Leica SP8 laser scanning confocal microscope nga adunay puti nga laser, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens ug usa ka heating stage.
Ang ilaga dali nga gi-anestesya gamit ang carbon dioxide ug gipunggotan og ulo, ang utok dali nga gikuha gikan sa bagolbagol, ug gihiwa ngadto sa 200μm nga gibag-on (para sa 13C labeling experiment) o 275μm nga gibag-on (para sa duha ka photon experiment) sagittal section nga gipuno sa mosunod nga mga materyales. Ang ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) gipuno sa mosunod nga mga substansiya: 125 mM nga bugnaw kaayo, carbon-saturated (95% O2 ug 5% CO2) ubos nga Ca2 + artificial cerebrospinal fluid (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0.5 mM CaCl2 ug 3.5 mM MgCl2 (osmotic pressure nga 310 ngadto sa 330 mmol). Ibalhin ang nakuha nga mga hiwa sa utok ngadto sa usa ka pre-incubation chamber nga adunay mas taas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ug 2.0 mM MgCl2) Medium) pH 7.4 ug 310 ngadto sa 320 mmol).
Atol sa proseso sa imaging, ang mga hiwa gibalhin ngadto sa usa ka gipahinungod nga imaging room, ug ang eksperimento gihimo ubos sa padayon nga ACSF perfusion sa kanunay nga temperatura nga 32° hangtod 33°C. Usa ka multiphoton laser scanning microscope (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) nga adunay Leica 25x objective lens (NA 0.95, tubig), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ang gigamit para sa slice imaging. FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM sa Grx1-roGFP2. Ang mga pagbag-o sa cytoplasmic redox state sa mga PN gisukod pinaagi sa two-photon FLIM sa sagittal brain slices, diin ang Grx1-roGFP2 biosensor nag-target sa mga PN. Sa PN layer, ang acquisition field gipili mga 50 ngadto sa 80 μm sa ubos sa slice surface aron masiguro nga adunay mabuhi nga PN (nga mao, ang kakulang sa beaded structure o neuronal morphological changes ubay sa mga dendrite) ug ang double positive roGFP2 sensor ug AAV encoding shRNA PCx o ang control sequence niini (matag usa co-expressing mCherry). Kolektaha ang single-stack nga mga imahe nga adunay 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Detection: internal HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] ug image average sulod sa 2 ngadto sa 3 ka minuto gigamit aron masiguro nga igo nga mga photon ang nakolekta (1000 ka photon sa kinatibuk-an) para sa curve fitting. Ang pagkasensitibo sa Grx1-roGFP2 probe ug ang pag-verify sa mga kondisyon sa FLIM gihimo pinaagi sa pagmonitor sa lifespan value sa roGFP2 sa dihang gidugang ang exogenous 10 mM H2O2 sa perfusion ACSF (aron mapadako ang oxidation, nga moresulta sa dugang lifespan), ug dayon gidugang ang 2 mM dithiothreitol (gipakunhod ang degree sa reduction, nga moresulta sa pagkunhod sa lifespan) (Figure S8, D hangtod G). Gamita ang FLIMfit 5.1.1 software aron analisahon ang nakuha nga mga resulta, ihaom ang single exponential decay curve sa tibuok nga imahe ngadto sa gisukod nga IRF (instrument response function), ug ang χ2 gibana-bana nga 1. Aron makalkulo ang lifetime sa usa ka single PN, ang mask sa palibot sa nerve body gidrowing mano-mano, ug ang average lifetime sa matag mask gigamit alang sa quantification.
Pag-analisa sa potensyal sa mitochondrial. Human ang acute section gi-incubate gamit ang 100 nM TMRM nga direktang gidugang sa perfused ACSF sulod sa 30 minutos, ang mga pagbag-o sa potensyal sa mitochondrial sa PNs gisukod gamit ang two-photon microscope. Ang TMRM imaging gihimo pinaagi sa pag-excite sa probe sa 920 nm ug paggamit sa internal HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) aron mangolekta og mga signal; pinaagi sa paggamit sa parehas nga excitation wavelength apan paggamit og lahi nga internal HyD (FITC: 525/50) aron i-imahe ang mtYFP. Gamita ang Image Calculator plug-in sa ImageJ aron masusi ang potensyal sa mitochondrial sa single cell level. Sa laktod nga pagkasulti, ang plug-in equation: signal = min (mtYFP, TMRM) gigamit aron mailhan ang rehiyon sa mitochondrial nga nagpakita sa signal sa TMRM sa Purkinje Somali sa single-stack confocal image sa katugbang nga channel. Dayon ang pixel area sa resulta nga mask gi-quantify, ug dayon gi-normalize sa katugbang nga threshold single-stack image sa mtYFP channel aron makuha ang mitochondrial fraction nga nagpakita sa mitochondrial potential.
Ang imahe gi-deconvolute gamit ang Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. Para sa mga na-scan nga litrato sa mga tile, ang montage sa usa ka tile gihimo gamit ang automatic stitching algorithm nga gihatag sa LAS-X software. Human sa image calibration, gamita ang ImageJ ug Adobe Photoshop aron maproseso pa ang imahe ug parehas nga ma-adjust ang brightness ug contrast. Gamita ang Adobe Illustrator para sa graphic preparation.
Pag-analisa sa pokus sa mtDNA. Ang gidaghanon sa mga lesyon sa mtDNA gikwenta sa mga seksyon sa cerebellar nga gimarkahan og mga antibody batok sa DNA pinaagi sa confocal microscope. Ang matag target nga lugar gihimo para sa lawas sa selula ug sa nucleus sa matag selula, ug ang tagsa-tagsa ka lugar gikalkulo gamit ang Multi Measure plug-in (ImageJ software). I-iban ang nuclear area gikan sa lugar sa lawas sa selula aron makuha ang cytoplasmic area. Sa katapusan, ang Analyze Particles plug-in (ImageJ software) gigamit aron awtomatikong ikwenta ang mga cytoplasmic DNA point nga nagpakita sa mtDNA sa threshold image, ug ang nakuha nga mga resulta gi-normalize sa PN average sa CTRL nga mga ilaga. Ang mga resulta gipahayag isip average nga gidaghanon sa mga nucleosides matag selula.
Pag-analisar sa ekspresyon sa protina. Gamita ang Image Calculator plug-in sa ImageJ aron masusi ang ekspresyon sa protina sa PN sa single cell level. Sa laktod nga pagkasulti, sa single-layer confocal image sa katugbang nga channel, pinaagi sa equation: signal = min (mtYFP, antibody), ang rehiyon sa mitochondrial nga nagpakita og immunoreactivity sa usa ka piho nga antibody sa Purkina mailhan. Dayon ang pixel area sa resulta nga mask gi-quantify, ug dayon gi-normalize sa katugbang nga threshold single-stack image sa mtYFP channel aron makuha ang mitochondrial fraction sa gipakita nga protina.
Pag-analisa sa densidad sa selula sa Purkinje. Ang Cell Counter plug-in sa ImageJ gigamit aron masusi ang densidad sa Purkinje pinaagi sa pagbahin sa gidaghanon sa mga selula sa Purkinje nga giihap sa gitas-on sa cerebellar ring nga giokupar sa giihap nga mga selula.
Pag-andam ug pagkolekta sa sampol. Ang mga utok gikan sa control group ug Mfn2cKO nga mga ilaga gi-fix sa 2% PFA/2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M phosphate buffer (PB), ug dayon ang mga coronal section giandam gamit ang mga ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Gibag-on 50 hangtod 60 μm) Dayon gi-fix sa PB buffer sa 1% os tetraoxide ug 1.5% potassium ferrocyanide sa temperatura sa kwarto sulod sa 1 ka oras. Ang mga seksyon gihugasan sa tulo ka beses gamit ang distilled water, ug dayon gi-stain gamit ang 70% ethanol nga adunay 1% uranyl acetate sulod sa 20 ka minuto. Ang mga seksyon gi-dehydrate dayon sa graded alcohol ug gi-embed sa Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) taliwala sa silicon-coated glass slides, ug sa katapusan sa 60°C Polymerize sa oven sulod sa 48 ka oras. Ang cerebellar cortex area gipili ug ang 50 nm ultrathin nga mga seksyon giputol sa Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) ug gikuha sa usa ka 2×1 mm nga copper slit grid nga gitabonan og polystyrene film. Ang mga seksyon gipintalan og solusyon nga 4% uranyl acetate sa H2O sulod sa 10 ka minuto, gihugasan gamit ang H2O sa makadaghang higayon, dayon gamit ang Reynolds lead citrate sa H2O sulod sa 10 ka minuto, ug dayon gihugasan gamit ang H2O sa makadaghang higayon. Ang mga micrograph gikuha gamit ang transmission electron microscope nga Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gamit ang TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Germany).
Para sa mga ilaga nga nataptan sa AAV, ang utok gibulag ug gihiwa ngadto sa 1 mm nga gibag-on nga sagittal section, ug ang cerebellum gisusi gamit ang fluorescence microscope aron mailhan ang singsing nga nataptan sa AAV (nga mao, ang mCherry expressing). Ang mga eksperimento lamang diin ang AAV injection moresulta sa taas kaayo nga transduction efficiency sa Purkinje cell layer (ie halos ang tibuok layer) sa labing menos duha ka sunod-sunod nga cerebellar rings ang gigamit. Ang AAV-transduced loop gi-microdissected alang sa overnight post-fixation (4% PFA ug 2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M cocoate buffer) ug giproseso pa. Para sa EPON embedding, ang fixed tissue gihugasan gamit ang 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), ug gi-incubate gamit ang 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) sa 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) sulod sa 4 ka oras, dayon gihugasan sulod sa 2 ka oras. Balika kini 3 ka beses gamit ang 0.1 M cocamide buffer. Sunod niini, ang ascending series sa ethanol gigamit sa pag-incubate sa matag ethanol solution sa 4°C sulod sa 15 minutos aron ma-dehydrate ang tissue. Ang tissue gibalhin sa propylene oxide ug gi-incubate tibuok gabii sa EPON (Sigma-Aldrich) sa 4°C. Ibutang ang tissue sa presko nga EPON sa temperatura sa kwarto sulod sa 2 ka oras, ug dayon i-embed kini sa 62°C sulod sa 72 ka oras. Gamita ang ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) ug diamond knife (Diatome, Biel, Switzerland) aron putlon ang 70 nm ultrathin nga mga seksyon, ug butangi og 1.5% uranyl acetate sulod sa 15 minutos sa 37°C, ug butangi og lead citrate solution sulod sa 4 ka minutos. Ang mga electron micrograph gikuha gamit ang JEM-2100 Plus transmission electron microscope (JEOL) nga adunay Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ug DigitalMicrograph software (Gatan). Para sa pag-analisa, ang mga electron micrograph nakuha gamit ang 5000× o 10,000× digital zoom.
Morpolohikal nga pag-analisar sa mitochondria. Alang sa tanang pag-analisar, ang mga kontorno sa indibidwal nga mitochondria gi-outline sa mano-mano sa mga digital nga imahe gamit ang ImageJ software. Lain-laing mga parametro sa morpolohiya ang gi-analisar. Ang densidad sa mitochondrial gipahayag isip porsyento nga nakuha pinaagi sa pagbahin sa kinatibuk-ang mitochondrial area sa matag selula sa cytoplasm area (cytoplasm area = cell area-cell nucleus area) × 100. Ang pagkalingin sa mitochondria gikalkulo gamit ang pormula [4π∙(area/perimeter 2)]. Ang ista morphology sa mitochondria gi-analisar ug gibahin sa duha ka kategorya (“tubular” ug “blister”) sumala sa ilang pangunang mga porma.
Pag-analisar sa gidaghanon ug densidad sa autophagosome/lysosome. Gamita ang ImageJ software aron mano-mano nga i-outline ang mga contour sa matag autophagosome/lysosome sa digital nga imahe. Ang autophagosome/lysosome area gipahayag isip porsyento nga gikalkulo pinaagi sa pagbahin sa kinatibuk-ang autophagosome/lysosome structure area sa matag cell sa cytoplasm area (cytoplasm area=cell area-nucleus area)×100. Ang densidad sa mga autophagosome/lysosome gikalkulo pinaagi sa pagbahin sa kinatibuk-ang numero sa gidaghanon sa mga autophagosome/lysosome structures kada cell (sa termino sa cytoplasmic area) (cytoplasmic area = cell area-nuclear area).
Pag-label para sa acute sectioning ug pag-andam sa sample. Para sa mga eksperimento nga nanginahanglan og glucose labeling, ibalhin ang acute brain slices ngadto sa pre-incubation chamber, nga adunay sulod nga saturated carbon (95% O2 ug 5% CO2), taas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ug 2.0 mM MgCl2, gi-adjust sa pH 7.4 ug 310 ngadto sa 320 mOsm), diin ang glucose kay 13C6- Glucose substitution (Eurisotop, catalog number CLM-1396). Para sa mga eksperimento nga nanginahanglan og pyruvate labeling, ibalhin ang acute brain slices ngadto sa mas taas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ug Idugang ang 2.0mM MgCl2, i-adjust sa pH 7.4 ug 310 ngadto sa 320mOsm), ug idugang ang 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, catalog number CLM-1082). I-incubate ang mga seksyon sulod sa 90 minutos sa 37°C. Sa katapusan sa eksperimento, ang mga seksyon dali nga gihugasan gamit ang aqueous solution (pH 7.4) nga adunay 75 mM ammonium carbonate, ug dayon gi-homogenize sa 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: tubig. Human ang mga seksyon gi-incubate sa yelo sulod sa 30 minutos, ang mga sample gi-centrifuge sa 21,000 g sulod sa 10 minutos sa 4°C, ug ang tin-aw nga supernatant gipauga sa usa ka SpeedVac concentrator. Ang resulta nga uga nga metabolite pellet gitipigan sa -80°C hangtod sa pag-analisa.
Pag-analisa sa Liquid chromatography-mass spectrometry sa 13 ka C-labeled amino acids. Para sa liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis, ang metabolite pellet gi-resuspend sa 75μl sa LC-MS grade nga tubig (Honeywell). Human sa centrifugation sa 21,000 g sulod sa 5 ka minuto sa 4°C, 20 μl sa giklaro nga supernatant ang gigamit para sa amino acid flux analysis, samtang ang nahabilin nga extract gigamit dayon para sa anion analysis (tan-awa sa ubos). Ang amino acid analysis gihimo gamit ang naunang gihulagway nga benzoyl chloride derivatization protocol (55, 56). Sa unang lakang, 10μl sa 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) ang gidugang sa 20μl sa metabolite extract, ug dayon 10μl sa 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) ang gidugang sa LC grade ACN. Ang sample gi-vortex sa makadiyot ug dayon gi-centrifuge sa 21,000 g sulod sa 5 ka minuto sa 20°C. Ibalhin ang nalimpyo nga supernatant ngadto sa usa ka 2 ml nga autosampler vial nga adunay conical glass insert (200 μl nga volume). Ang mga sample gi-analisa gamit ang Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) nga konektado sa Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Alang sa pag-analisa, 2μl sa derivatized sample ang gi-inject sa usa ka 100×1.0 mm high-strength silica T3 column (Waters) nga adunay 1.8μm nga mga partikulo. Ang flow rate kay 100μl/min, ug ang buffer system gilangkoban sa buffer A (10 mM ammonium formate ug 0.15% formic acid sa tubig) ug buffer B (ACN). Ang gradient mao ang mosunod: 0%B sa 0 ka minuto; 0%B. 0 ngadto sa 15% B sa 0 ngadto sa 0.1 ka minuto; 15 ngadto sa 17% B sa 0.1 ngadto sa 0.5 ka minuto; B sa 17 ngadto sa 55% sa 0.5 ngadto sa 14 ka minuto; B sa 55 ngadto sa 70% sa 14 ngadto sa 14.5 ka minuto; sa 14.5 ngadto sa 70 ngadto sa 100% B sa 18 ka minuto; 100% B sa 18 ngadto sa 19 ka minuto; 100 ngadto sa 0% B sa 19 ngadto sa 19.1 ka minuto; 0% B sa 19.1 ngadto sa 28 ka minuto (55, 56). Ang QE-HF mass spectrometer naglihok sa positive ionization mode nga adunay mass range nga m/z (mass/charge ratio) nga 50 hangtod 750. Ang gigamit nga resolution kay 60,000, ug ang nakuha nga gain control (AGC) ion target kay 3×106, ug ang maximum ion time kay 100 milliseconds. Ang heated electrospray ionization (ESI) source naglihok sa spray voltage nga 3.5 kV, capillary temperature nga 250°C, sheath airflow nga 60 AU (arbitrary units), ug auxiliary airflow nga 20 AU. 250°C. Ang S lens gibutang sa 60 AU.
Anion chromatography-MS analysis sa 13C nga gimarkahan og organic acids. Ang nahibiling metabolite precipitate (55μl) gi-analisa gamit ang Dionex ion chromatography system (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) nga konektado sa QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Sa laktod nga pagkasulti, 5μl nga metabolite extract ang gi-inject sa usa ka Dionex IonPac AS11-HC column nga adunay HPLC (2 mm×250 mm, particle size 4μm, Thermo Fisher Scientific) sa push-in partial loop mode nga adunay filling ratio nga 1. ) Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Ang temperatura sa column gimentinar sa 30°C, ug ang autosampler gibutang sa 6°C. Gamita ang potassium hydroxide cartridge nga adunay deionized nga tubig aron makamugna og potassium hydroxide gradient pinaagi sa eluent generator. Pagbulag sa mga metabolite sa flow rate nga 380μl/min, gamit ang mosunod nga gradient: 0 hangtod 3 ka minuto, 10 mM KOH; 3 hangtod 12 ka minuto, 10 hangtod 50 mM KOH; 12 hangtod 19 ka minuto, 50 hangtod 100 mM KOH; 19 hangtod 21 ka minuto, 100 mM KOH; 21 hangtod 21.5 ka minuto, 100 hangtod 10 mM KOH. Ang kolum gi-equilibrate pag-usab ubos sa 10 mM KOH sulod sa 8.5 ka minuto.
Ang mga metabolite nga na-elute gihiusa sa usa ka 150μl/min nga isopropanol supplement stream human sa column ug dayon gidirekta ngadto sa usa ka high-resolution mass spectrometer nga nag-operate sa negative ionization mode. Ang MS nagmonitor sa mass range gikan sa m/z 50 ngadto sa 750 nga adunay resolution nga 60,000. Ang AGC gitakda sa 1×106, ug ang maximum ion time gipadayon sa 100 ms. Ang gipainit nga ESI source gipadagan sa spray voltage nga 3.5 kV. Ang ubang mga setting sa ion source mao ang mosunod: capillary temperature 275°C; sheath gas flow, 60 AU; auxiliary gas flow, 20 AU sa 300°C, ug S lens setting ngadto sa 60 AU.
Pag-analisar sa datos sa 13C nga gimarkahan nga mga metabolite. Gamita ang TraceFinder software (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific) para sa pag-analisar sa datos sa isotope ratio. Ang identidad sa matag compound gipamatud-an sa usa ka kasaligan nga reference compound ug gi-analisar nga independente. Aron mahimo ang pag-analisar sa pagpayaman sa isotope, ang lugar sa nakuha nga ion chromatogram (XIC) sa matag 13C isotope (Mn) gikuha gikan sa [M + H] +, diin ang n mao ang carbon number sa target compound, nga gigamit sa pag-analisar sa mga amino acid o [MH] + gigamit sa pag-analisar sa mga anion. Ang katukma sa masa sa XIC ubos sa lima ka bahin kada milyon, ug ang katukma sa RT kay 0.05 minutos. Ang pag-analisar sa pagpayaman gihimo pinaagi sa pagkalkulo sa ratio sa matag nakit-an nga isotope sa suma sa tanan nga isotope sa katugbang nga compound. Kini nga mga ratio gihatag isip mga kantidad sa porsyento para sa matag isotope, ug ang mga resulta gipahayag isip molar percent enrichment (MPE), sama sa gihulagway kaniadto (42).
Ang nagyelo nga neuron pellet gi-homogenize sa bugnaw kaayong 80% methanol (v/v), gi-vortex, ug gi-incubate sa -20°C sulod sa 30 minutos. I-vortex pag-usab ang sample ug isagol sa +4°C sulod sa 30 minutos. Ang sample gi-centrifuge sa 21,000 g sulod sa 5 minutos sa 4°C, ug dayon ang resulta nga supernatant gikolekta ug gipauga gamit ang SpeedVac concentrator sa 25°C para sa sunod nga pag-analisa. Sama sa gihulagway sa ibabaw, gihimo ang LC-MS analysis sa mga amino acid sa gi-sort nga mga cell. Gamit ang TraceFinder (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific), gihimo ang data analysis gamit ang monoisotopic mass sa matag compound. Gihimo ang quantile normalization sa metabolite data gamit ang preprocessCore software package (57).
Pag-andam sa hiwa. Ang ilaga dali nga gi-anesthesia gamit ang carbon dioxide ug gipunggotan og ulo, ang utok dali nga gikuha gikan sa bagolbagol, ug ang ice-filled vibrating knife (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) gigamit sa pagputol niini ngadto sa 300 ngadto sa 375 μm sagittal nga mga seksyon. Bugnaw nga carbon gasification (95% O2 ug 5% CO2) Ubos nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ug 6.0 mM MgCl2 I-adjust sa pH 7.4 ug 310 ngadto sa 330 mOsm). Ibalhin ang nakuha nga mga hiwa sa utok ngadto sa usa ka lawak nga adunay mas taas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 ug mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ug 310 ngadto sa 320 mOsm). Tipigi ang mga hiwa sulod sa 20 ngadto sa 30 ka minuto aron kini mabalik sa normal sa dili pa irekord.
pagrekord. Usa ka yugto sa mikroskopyo nga adunay pirmi nga recording chamber ug usa ka 20x water immersion objective lens (Scientifica) ang gigamit para sa tanang rekording. Ang gituohang Purkinje cells giila pinaagi sa (i) gidak-on sa lawas, (ii) anatomical location sa cerebellum, ug (iii) expression sa fluorescent mtYFP reporter gene. Ang patch pipette nga adunay tip resistance nga 5 ngadto sa 11 megohms gibira pagawas sa usa ka borosilicate glass capillary (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) ug usa ka horizontal pipette Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Ang tanang rekording gihimo gamit ang ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), nga gikontrolar sa software nga Signal (bersyon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Ang eksperimento girekord sa sampling rate nga 12.5 kHz. Ang signal gisala gamit ang duha ka short-pass Bessel filters nga adunay cutoff frequencies nga 1.3 ug 10 kHz matag usa. Ang capacitance sa membrane ug sa pipette gi-compensate sa compensation circuit gamit ang amplifier. Ang tanang eksperimento gihimo ubos sa kontrol sa usa ka Orca-Flash 4.0 camera (Hamamatsu, Gerden, Germany), nga gikontrol sa Hokawo software (bersyon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany).
Rutinang pag-configure ug pag-analisa sa tibuok selula. Sa dili pa magrekord, pun-a ang pipette sa internal nga solusyon nga adunay mosunod nga mga substansiya: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) ug 10.0 mM creatinine phosphate ang gi-adjust sa pH 7.25, ug ang osmotic pressure kay 290 mOsm (sucrose). Human dayon sa pag-apply og puwersa nga 0 pA aron mabuak ang lamad, gisukod ang resting membrane potential. Ang input resistance gisukod pinaagi sa pag-apply og hyperpolarized currents nga -40, -30, -20, ug -10 pA. Sukda ang gidak-on sa voltage response ug gamita ang Ohm's law aron makalkulo ang input resistance. Ang kusang kalihokan girekord sa usa ka voltage clamp sulod sa 5 ka minuto, ug ang sPSC giila ug gisukod sa Igor Pro (bersyon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) gamit ang semi-automatic recognition script. Ang IV curve ug steady-state current gisukod pinaagi sa pag-clamp sa baterya sa lainlaing mga potensyal (sugod sa -110 mV) ug pagdugang sa boltahe sa 5 mV nga mga lakang. Ang produksiyon sa AP gisulayan pinaagi sa pag-apply sa depolarizing current. I-clamp ang cell sa -70 mV samtang nag-apply sa depolarizing current pulse. I-adjust ang step size sa matag recording unit nga gilain (10 hangtod 60 pA). Kwentaha ang maximum AP frequency pinaagi sa mano-manong pag-ihap sa mga pulse spike nga hinungdan sa labing taas nga AP frequency. Ang AP threshold gisusi pinaagi sa paggamit sa ikaduhang derivative sa depolarization pulse nga unang nag-trigger sa usa o daghan pang mga AP.
Pag-configure ug pag-analisa sa perforated patch. Paghimo og perforated patch recording gamit ang standard protocols. Gamita ang ATP- ug GTP-free pipette nga walay mosunod nga mga sangkap: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ug 2 mM MgCl2, ug i-adjust sa pH 7.2 (gamit ang KOH). Ang ATP ug GTP wala iapil sa intracellular solution aron malikayan ang dili makontrol nga permeability sa cell membrane. Ang patch pipette gipuno sa amphotericin-containing internal solution (gibana-bana nga 200 hangtod 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) aron makakuha og punched patch record. Ang amphotericin gitunaw sa dimethyl sulfoxide (final concentration: 0.1 hangtod 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ang konsentrasyon sa DMSO nga gigamit walay dakong epekto sa mga neuron nga gitun-an. Atol sa proseso sa pagsuntok, ang resistensya sa channel (Ra) padayon nga gimonitor, ug ang eksperimento gisugdan human ang amplitude sa Ra ug AP na-stabilize (20-40 minutos). Ang kusang kalihokan gisukod sa usa ka boltahe ug/o karon nga clamp sulod sa 2 ngadto sa 5 ka minuto. Ang pag-analisa sa datos gihimo gamit ang Igor Pro (bersyon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (bersyon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) ug GraphPad Prism (bersyon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Aron mailhan ang kusang mga AP, gigamit ang NeuroMatic v3.0c plug-in sa IgorPro. Awtomatikong mailhan ang mga AP gamit ang gihatag nga threshold, nga gi-adjust matag usa alang sa matag record. Gamit ang spike interval, tinoa ang spike frequency nga adunay pinakataas nga instantaneous spike frequency ug ang average spike frequency.
Pag-isolate sa PN. Pinaagi sa pagpahiangay sa naunang gipatik nga protocol, ang mga PN giputli gikan sa cerebellum sa ilaga sa usa ka piho nga yugto (58). Sa laktod nga pagkasulti, ang cerebellum gi-dissect ug gi-minced sa bugnaw kaayo nga dissociation medium [walay HBSS Ca2+ ug Mg2+, gidugangan og 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) ug streptomycin (0.05 mg/ml)], ug dayon gitunaw ang medium sa papain [HBSS, gidugangan og 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) ug deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Tabuni sulod sa 30 minutos sa 30°C. Una, hugasi ang mga tisyu sa HBSS medium nga adunay egg mucus (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ug DNase (0.1 mg/ml) sa temperatura sa kwarto aron malikayan ang enzymatic digestion, ug dayon sa HBSS medium nga adunay 20 mM glucose. Hinayhinay nga gigaling ang HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) ug DNase (0.1 mg/ml) aron mopagawas sa mga single cells. Ang resulta nga cell suspension gisala pinaagi sa 70μm cell strainer, dayon ang mga cell gi-pellet pinaagi sa centrifugation (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) ug gi-resuspend sa sorting medium [HBSS, nga gidugangan og 20 mM glucose, 20% fetal bovine) Serum, penicillin (50 U/ml) ug streptomycin (0.05 mg/ml)]; susiha ang cell viability gamit ang propidium iodide ug i-adjust ang cell density ngadto sa 1×106 ngadto sa 2×106 cells/ml. Sa wala pa ang flow cytometry, ang suspensyon gisala pinaagi sa 50 μm cell strainer.
Flow cytometer. Ang pag-sort sa selula gihimo sa 4°C gamit ang FACSAria III machine (BD Biosciences) ug FACSDiva software (BD Biosciences, bersyon 8.0.1). Ang cell suspension gi-sort gamit ang 100 μm nozzle ubos sa pressure nga 20 psi sa rate nga ~2800 events/sec. Tungod kay ang tradisyonal nga gating criteria (gidak-on sa selula, bimodal discrimination, ug scattering characteristics) dili makasiguro sa saktong isolation sa PN gikan sa ubang mga klase sa selula, ang gating strategy gitakda base sa direktang pagtandi sa YFP intensity ug autofluorescence sa mitoYFP+ ​​​​ug sa control mitoYFP − Mice. Ang YFP gi-excite pinaagi sa pag-irradiate sa sample gamit ang 488 nm laser line, ug ang signal nakita gamit ang 530/30 nm band pass filter. Sa mitoYFP+ ​​​​nga mga ilaga, ang relatibong kusog sa Rosa26-mitoYFP reporter gene gigamit usab aron mailhan ang mga neuronal body ug axon fragments. Ang 7-AAD gi-excite gamit ang 561 nm yellow laser ug gi-detect gamit ang 675/20 nm bandpass filter aron dili maapil ang mga patay nga selula. Aron mabulag ang mga astrocytes sa samang higayon, ang cell suspension gi-stain gamit ang ACSA-2-APC, dayon ang sample gi-irradiate gamit ang 640 nm laser line, ug usa ka 660/20 nm bandpass filter ang gigamit aron ma-detect ang signal.
Ang nakolekta nga mga selula gi-pellet pinaagi sa centrifugation (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) ug gitipigan sa -80°C hangtod gamiton. Ang mga ilaga nga Mfn2cKO ug ang ilang mga itoy giklasipikar sa samang adlaw aron maminusan ang pagkalainlain sa pamaagi. Ang presentasyon ug pag-analisa sa datos sa FACS gihimo gamit ang FlowJo software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Sama sa nahisgotan sa ibabaw (59), ang real-time PCR gigamit aron ibulag ang DNA gikan sa gi-sort nga mga neuron alang sa sunod nga mtDNA quantification. Ang linearity ug threshold sensitivity unang gisulayan pinaagi sa pagpadagan sa qPCR sa lain-laing gidaghanon sa mga selula. Sa laktod nga pagkasulti, kolektaha ang 300 PN sa usa ka lysis buffer nga gilangkoban sa 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ug proteinase K (200 ng/ml) ug i-incubate sa 55°C sulod sa 120 ka minuto. Ang mga selula gi-incubate pa sa 95°C sulod sa 10 ka minuto aron masiguro ang kompleto nga inactivation sa proteinase K. Gamit ang TaqMan probe (Thermo Fisher) nga espesipiko sa mt-Nd1, ang mtDNA gisukod pinaagi sa semi-quantitative PCR sa 7900HT Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific). Siyensiya, numero sa katalogo nga Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero sa katalogo nga AIVI3E8) ug 18S (Thermo Fisher Scientific, numero sa katalogo nga Hs99999901_s1) nga mga gene.
Pag-andam sa sample sa proteome. Pinaagi sa pagpainit sa solusyon sa 95°C sulod sa 10 ka minuto ug pag-sonicate, sa lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide ug 100 mM tris-Lyse frozen neuron pellets sa HCl]. Sa Bioruptor (Diagenode) sulod sa 10 ka minuto (30 segundos nga pulse / 30 segundos nga pause period). Ang sample gi-dilute og 1:10 sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0), gisagol sa 300 ng trypsin gold (Promega), ug gi-incubate sa tibuok gabii sa 37°C aron makab-ot ang kompleto nga digestion. Sa ikaduhang adlaw, ang sample gi-centrifuge sa 20,000 g sulod sa 20 ka minuto. Ang supernatant gi-dilute og 0.1% formic acid, ug ang solusyon gi-desalt gamit ang self-made StageTips. Ang sample gipauga sa usa ka SpeedVac instrument (Eppendorf concentrator plus 5305) sa 45°C, ug dayon ang peptide gisuspinde sa 0.1% formic acid. Ang tanang sample giandam sa samang tawo. Aron ma-analisa ang mga sample sa astrocyte, 4 μg nga desalted peptides gimarkahan og tandem mass tag (TMT10plex, catalog number 90110, Thermo Fisher Scientific) nga adunay peptide to TMT reagent ratio nga 1:20. Para sa TMT labeling, 0.8 mg nga TMT reagent gi-resuspend sa 70 μl nga anhydrous ACN, ug ang uga nga peptide gi-reconstitute ngadto sa 9 μl nga 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), diin gidugang ang 7 μl nga TMT reagent sa ACN. Ang konsentrasyon kay 43.75%. Human sa 60 minutos nga incubation, ang reaksyon gi-quench gamit ang 2 μl nga 5% hydroxylamine. Ang mga gimarkahan nga peptide gikolekta, gipauga, gi-suspend pag-usab sa 200μl nga 0.1% formic acid (FA), gibahin sa duha, ug dayon gi-desalt gamit ang kaugalingong hinimo nga StageTips. Gamit ang UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), usa sa duha ka bahin ang gi-fraksion sa usa ka 1mm x 150mm Acquity chromatographic column nga gisudlan og 130Å1.7μm C18 particles (Waters, catalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Ibulag ang mga peptide sa flow rate nga 30μl/min, ibulag gikan sa 1% ngadto sa 50% buffer B sulod sa 85 minutos nga adunay stepwise gradient nga 96 minutos, gikan sa 50% ngadto sa 95% buffer B sulod sa 3 minutos, dayon 8 minutos para sa 95% Buffer B; Ang buffer A kay 5% ACN ug 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), ug ang buffer B kay 80% ACN ug 10 mM ABC. Kolektaha ang mga fraction matag 3 ka minuto ug isagol kini sa duha ka grupo (1 + 17, 2 + 18, ug uban pa) ug paugha kini sa vacuum centrifuge.
LC-MS/MS analysis. Para sa mass spectrometry, ang mga peptide (numero r119.aq) gibulag sa usa ka 25 cm, 75 μm inner diameter nga PicoFrit analytical column (bag-ong objective lens, part number PF7508250) nga adunay 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), Gamita ang EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany). Ang column gimentinar sa 50°C. Ang Buffers A ug B kay 0.1% formic acid sa tubig ug 0.1% formic acid sa 80% ACN, matag usa. Ang mga peptide gibulag gikan sa 6% ngadto sa 31% buffer B sulod sa 65 minutos ug gikan sa 31% ngadto sa 50% buffer B sulod sa 5 minutos nga adunay gradient nga 200 nl/min. Ang mga eluted peptide gisusi sa usa ka Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Ang pagsukod sa peptide precursor m/z gihimo nga adunay resolusyon nga 120,000 sa range nga 350 hangtod 1500 m/z. Gamit ang 27% nga normalized collision energy, ang pinakakusog nga precursor nga adunay charge state nga 2 hangtod 6 ang gipili para sa high energy C trap dissociation (HCD) cleavage. Ang cycle time gitakda sa 1 s. Ang m/z value sa peptide fragment gisukod sa ion trap gamit ang pinakagamay nga AGC target nga 5×104 ug ang maximum injection time nga 86 ms. Human sa fragmentation, ang precursor gibutang sa dynamic exclusion list sulod sa 45 s. Ang mga peptide nga may label nga TMT gibulag sa usa ka 50 cm, 75 μm nga Acclaim PepMap column (Thermo Fisher Scientific, catalog number 164942), ug ang migration spectra gi-analisa sa usa ka Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) nga adunay high-field asymmetric waveform ions (FAIMS) nga kagamitan (Thermo Fisher Scientific) nga naglihok sa duha ka compensation voltages nga −50 ug −70 V. Ang MS3 nga gipili base sa synchronization precursor gigamit para sa pagsukod sa TMT report ion signal. Ang peptide separation gihimo sa EASY-nLC 1200, gamit ang 90% linear gradient elution, nga adunay buffer concentration nga 6% hangtod 31%; ang buffer A kay 0.1% FA, ug ang buffer B kay 0.1% FA ug 80% ACN. Ang analytical column gi-operate sa 50°C. Gamita ang FreeStyle (bersyon 1.6, Thermo Fisher Scientific) aron bahinon ang orihinal nga file sumala sa FAIMS compensation voltage.
Pag-ila ug pagkwenta sa protina. Gamit ang integrated Andromeda search engine, ang orihinal nga datos gisusi gamit ang MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Gawas pa sa Cre recombinase ug YFP sequences nga nakuha gikan sa Aequorea victoria, ang peptide fragment spectra gipangita alang sa canonical sequence ug isoform sequence sa mouse reference proteome (Proteome ID UP000000589, gi-download gikan sa UniProt niadtong Mayo 2017). Ang methionine oxidation ug protein N-terminal acetylation gibutang isip variable modifications; ang cysteine ​​​​carbamoyl methylation gibutang isip fixed modifications. Ang mga digestion parameter gibutang sa "specificity" ug "trypsin/P". Ang minimum nga gidaghanon sa mga peptide ug razor peptides nga gigamit alang sa pag-ila sa protina kay 1; ang minimum nga gidaghanon sa unique peptides kay 0. Ubos sa mga kondisyon sa peptide map matching, ang protein identification rate kay 0.01. Ang opsyon nga "Second Peptide" gi-enable. Gamita ang opsyon nga “match between runs” aron ibalhin ang malampusong mga identipikasyon tali sa lain-laing orihinal nga mga file. Gamita ang LFQ minimum ratio count 1 para sa label-free quantification (LFQ) (60). Ang LFQ intensity gisala para sa labing menos duha ka balido nga kantidad sa labing menos usa ka genotype group sa matag time point, ug gi-extrapolate gikan sa normal distribution nga adunay gilapdon nga .0.3 ug mobalhin paubos sa 1.8. Gamita ang Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) ug R (https://r-project.org/) aron analisahon ang mga resulta sa LFQ. Usa ka two-way moderate t test gikan sa limma software package ang gigamit para sa differential expression analysis (61). Ang exploratory data analysis gihimo gamit ang ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ug pheatmap. Ang TMT-based proteomics data gi-analisa gamit ang MaxQuant version 1.6.10.43. Pangitaa ang hilaw nga datos sa proteomics gikan sa database sa human proteomics sa UniProt, nga gi-download niadtong Septyembre 2018. Ang pag-analisa naglakip sa isotope purity correction factor nga gihatag sa tiggama. Gamita ang limma sa R ​​para sa differential expression analysis. Ang orihinal nga datos, mga resulta sa pagpangita sa database, ug ang workflow ug mga resulta sa pag-analisa sa datos gitipigan tanan sa ProteomeXchange alliance pinaagi sa PRIDE partner repository nga adunay data set identifier nga PXD019690.
Ang mga functional annotation nagpayaman sa pag-analisa. Ang Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) nga himan gigamit aron mahibal-an ang kadato sa mga termino sa functional annotation sa data set sa 8 ka semana (Figure 1). Sa laktod nga pagkasulti, ang quantitative protein list nga nakuha gikan sa LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) data analysis gigamit uban ang mosunod nga filter criteria: Ang Mus musculus gipili isip species ug background, ug ang kategorya nagpakita nga ang P value nga gi-adjust ni Benjamini para sa enrichment nga 0.05 o mas ubos giisip nga significant. Para niini nga graph, ang top five excess categories sa matag cluster base sa adjusted P value gipakita. Gamit ang multiple t-test, gamit ang two-stage linear boost program ni Benjamini, Krieger, ug Yekutieli (Q = 5%), ang time-course protein expression analysis gihimo sa mga importanteng kandidato nga giila sa matag kategorya, ug ang matag row gi-analisa nga gilain. Dili kinahanglan nga mosagop og consistent SD.
Aron itandi ang mga resulta niini nga pagtuon sa mga gipatik nga database ug makahimo og Venn diagram sa Figure 1, among gihiusa ang quantitative protein list uban sa MitoCarta 2.0 annotation (24). Gamita ang online tool nga Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) aron makahimo og diagram.
Alang sa detalyadong impormasyon bahin sa mga pamaagi sa estadistika nga gigamit alang sa pag-analisar sa proteomics, palihug tan-awa ang katugbang nga seksyon sa Mga Materyales ug Pamaagi. Alang sa tanan nga uban pang mga eksperimento, ang detalyadong impormasyon makita sa katugbang nga leyenda. Gawas kon lahi ang giingon, ang tanan nga datos gipahayag isip mean ± SEM, ug ang tanan nga pag-analisar sa estadistika gihimo gamit ang GraphPad Prism 8.1.2 software.
Para sa dugang nga mga materyales para niining artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Kini usa ka open access nga artikulo nga giapod-apod ubos sa mga termino sa Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike License, nga nagtugot sa paggamit, pag-apod-apod, ug pagpatik pag-usab sa bisan unsang medium, basta ang katapusang paggamit dili alang sa komersyal nga ganansya ug ang premise mao nga ang orihinal nga buhat husto. Reperensya.
Pahinumdom: Among gihangyo lang nga ihatag nimo ang imong email address aron ang tawo nga imong girekomenda sa panid mahibalo nga gusto nimo nga makita nila ang email ug nga dili kini spam. Dili kami mokuha og bisan unsang email address.
Kini nga pangutana gigamit aron pagsulay kung ikaw usa ka bisita ug mapugngan ang awtomatikong pagsumite sa spam.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ang pag-analisar sa proteomics sa mga dysfunctional neuron nagpadayag nga ang mga programa sa metabolismo gi-aktibo aron masumpo ang neurodegeneration.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ang pag-analisar sa proteomics sa mga dysfunctional neuron nagpadayag nga ang mga programa sa metabolismo gi-aktibo aron masumpo ang neurodegeneration.
©2020 American Association for the Advancement of Science. ang tanan nga mga katungod gigahin. Ang AAAS kauban sa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ug COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.