Karon†Kasamtangang adres: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Ang reaction center light-harvesting complex 1 (RC-LH1) mao ang kinauyokan nga photosynthetic component sa purple phototrophic bacteria. Gipaila namo ang duha ka cryo-electron microscopy structures sa RC-LH1 complex gikan sa Rhodopseudomonas palustris. Ang 2.65-Å resolution structure sa RC-LH114-W complex gilangkoban sa 14 ka subunit LH1 loops nga naglibot sa RC, nga gibalda sa protein W, samtang ang complex nga walay protein-W hingpit nga RC composition nga gilibutan sa RC. Sirado nga 16 subunit LH1 loop. Ang pagtandi niini nga mga istruktura naghatag og mga panabut sa dinamika sa quinone sa RC-LH1 complex, lakip ang kaniadto wala pa matino nga mga pagbag-o sa conformational kung mag-binding sa quinone sa RC QB site, ingon man ang lokasyon sa auxiliary quinone binding sites, nga makatabang sa pagpasa niini ngadto sa RC. Ang talagsaon nga istruktura sa W protein nagpugong sa pagsira sa LH1 loop, sa ingon nagmugna og usa ka channel alang sa pagpadali sa quinone/quinolone exchange.
Ang enerhiya nga gihatag sa photosynthesis makasustiner sa halos tanang kinabuhi sa yuta, ug kini adunay dakong potensyal alang sa solar biotechnology. Samtang nagpasiugda sa global photosynthesis, ang purple phototrophic bacteria nagpakita usab og lain-laing mga paagi sa enerhiya ug mga kapabilidad sa metabolismo. Mahimo nilang malikayan ang photosynthesis ug motubo isip heterotrophic bacteria sa kangitngit, maka-fix sa nitrogen ug carbon dioxide, makahimo og hydrogen, ug makaguba sa mga aromatic compound (1-3). Aron makahatag og enerhiya alang niini nga mga proseso, ang kahayag kinahanglan nga dali ug episyente nga mabag-o ngadto sa kemikal nga enerhiya. Kini nga proseso magsugod kung ang light-trapping antenna complex mosuhop sa kahayag ug mobalhin sa natanggong nga enerhiya ngadto sa reaction center (RC), sa ingon magsugod ang charge separation (4 - 7). Ang sukaranan nga yunit sa photosynthesis sa purple phototrophic bacteria gilangkoban sa type 2 RC, nga gilibutan sa light-harvesting complex 1 (LH1), nga nagporma sa RC-LH1 core complex. Ang LH1 giporma sa usa ka array sa curved αβ heterodimers, nga ang matag usa nagbugkos sa duha ka bacterial chlorophyll (BChl) a molecules ug usa o duha ka carotenoids (8-12). Ang pinakasimple nga LH1 antenna gilangkoban sa 16 o 17 ka αβ heterodimers nga naglibot sa RC (9-13) sa usa ka closed loop, apan sa ubang core complexes, ang transmembrane peptides makabalda sa continuity sa palibot nga LH1, nga nagpasiugda sa quinol/quinone diffusion tali sa RC ug cytochrome bc1 complex (11, 13-15). Ang purple phototrophic plant nga Rhodopseudomonas (Rps.) usa ka model organism nga makasabot sa energy ug electron transfer nga nagsuporta sa photosynthesis. Ang unang crystal structure sa Rps. Ang modelo sa palustris RC-LH1 complex mao ang RC, nga gilibutan sa 15 ka heterodimeric LH1 loops, nga gibalda sa usa ka wala mailhi nga protina nga gitawag og "Protein W" (14). Ang Protein-W sa ulahi nailhan nga RPA4402, nga usa ka uncharacterized 10.5kDa protein nga adunay tulo ka gitagna nga transmembrane helices (TMH) (16). Among gisugyot nga usbon ang ngalan sa rpa4402 gene nga nag-encode sa protein W ngadto sa pufW aron mahiuyon sa nomenclature nga gigamit para sa mga gene nga nag-encode sa RC-L, M (pufL, pufM) ug LH1α, β (pufA, pufB) subunits. Makapainteres, ang protein-W anaa lamang sa mga 10% sa RC-LH1, nga nagpakita nga ang Rps. palustris nagpatunghag duha ka lain-laing RC-LH1 complexes. Dinhi, among gitaho ang high-resolution cryo-EM (cryo-EM) structures sa duha ka core complexes, usa nga adunay protein W ug 14 αβ heterodimers, ang lain walay protein W ug usa ka closed 16 Heterodimer LH1 loop. Ang among istruktura nagrepresentar sa usa ka lakang nga pagbag-o sa pagsabot sa RC-LH1 complex sa Rps. palustris, tungod kay among gisusi ang homogenous nga populasyon sa matag variant ug adunay igo nga resolusyon aron klaro nga i-assign ang matag peptide ug bound pigments ug mga may kalabutan nga lipid ug quinones. Ang pagtandi niining mga istruktura nagpakita nga ang tulo ka TMH protein-W nga wala pa makit-i sa bisan unsang ubang RC-LH1 complex hangtod karon nagmugna og quinone channel aron mapadali ang quinone/quinolone exchange. Daghang nakonserba nga lipid ug quinone binding sites ang nakit-an, ug among gipadayag ang usa ka bag-ong conformational change human sa kombinasyon sa quinone ug RC, nga mahimong angay alang sa photosystem II (PSII) RC sa oxygenated phototrophic organisms. Ang among mga nahibal-an naghatag og bag-ong mga panabut sa kinetics sa quinone/quinolone binding ug exchange sa RC-LH1 core complex sa purple phototrophic bacteria.
Aron mapadali ang detalyadong pagtuon sa duha ka complex nga nakit-an sa Rps. palustris, among gi-isolate ang matag RC-LH1 pinaagi sa biochemical methods. Ang protein W-deficient complex (nga dinhi gitawag nga ΔpufW) giputli gikan sa strain nga kulang sa pufW gene (16), ug usa ra ka RC-LH1 complex ang mahimo. Ang protein W-containing complex gihimo sa usa ka strain. Ang protein W niini nga strain gi-modify gamit ang 10x His tag sa C-terminus niini, aron ang protein W-containing complex epektibong mahiusa sa kadaghanan sa kulang nga protein W pinaagi sa pag-immobilize sa metal. Ang complex epektibong gibulag (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Sama sa gipakita sa Figure 1, ang duha ka complex adunay tulo ka sub-unit nga RC (RC-L, RC-M ug RC-H) nga gilibutan sa usa ka LH1 antenna. Ang 2.80-A nga istruktura sa complex nga kulang sa protein-W nagpakita og 16 ka αβ heterodimers, nga nagporma og usa ka sirado nga LH1 loop nga hingpit nga naglibot sa RC, dinhi gitawag nga RC-LH116 complex. Ang 2.65Å nga istruktura sa protein-W-containing complex adunay 14-heterodimer LH1 nga gibalda sa protein-W, dinhi gitawag nga RC-LH114-W.
(A ug B) Representasyon sa nawong sa compound. (C ug D) Mga pigment nga gi-bonded nga gipahayag sa mga rod. (E ug F) Ang mga complex nga naobserbahan gikan sa cytoplasmic surface adunay mga peptide ug LH1 subunit nga girepresentahan sa mga cartoon, ug ginumerohan og clockwise gikan sa protein-W gap [subay sa Rba numbering. sphaeroides complex (13)]. Para sa LH1-α, ang kolor sa protein subunit kay dilaw; para sa LH1-β, ang kolor sa protein subunit kay asul; para sa protein-W, ang protina kay pula; para sa RC-H, kini cyan; para sa RC-L, kini Orange; para sa RC-M, magenta. Ang mga cofactor girepresentahan sa mga rod, ang berde nagrepresentar sa mga molekula sa BChl ug BPh a, ang purple nagrepresentar sa mga carotenoid, ug ang dilaw nagrepresentar sa mga molekula sa UQ10. (G ug H) Gipadako nga panan-aw sa protein-W gap sa katumbas nga rehiyon sa RC-LH114-W complex (G) ug RC-LH116 complex (H). Ang mga cofactor gipakita sa porma sa pagpuno sa espasyo, ang chelated quinone gipakita sa asul. Ang protein-W gap gipasiugda sa usa ka asul nga putol-putol nga linya sa (G), ug ang gagmay nga mga lungag diin ang quinone/quinolol mokatap sa singsing sa LH116 gipasiugda sa usa ka itom nga putol-putol nga linya sa (H).
Ang Figure 1 (A ug B) nagpakita sa RC nga gilibutan sa bukas o sirado nga mga array sa LH1αβ heterodimers, nga ang matag usa nagbugkos sa duha ka BChl ug usa ka carotenoid (Figure 1, C ug D). Ang mga nangaging pagtuon nagpakita nga ang Rps mao ang LH1 complex. Sa biosynthetic pathway sa spirulina xanthin, kini nga mga espisye adunay sinagol nga populasyon sa carotenoids (17). Bisan pa, ang spiropyrroxanthin mao ang dominanteng carotenoid ug ang densidad niini makatagbaw. Busa, gipili namo nga i-modelo ang spiroxanthin sa tanang LH1 binding sites. Ang alpha ug beta polypeptides mga single TMH nga adunay mubo nga membrane outer regions (Figure 1, A, B, E, ug F). Bisan tuod ang densidad sa 17 ka residues sa C-terminus wala maobserbahan, ang alpha polypeptide giputol gikan sa Met1 ngadto sa Ala46 sa duha ka complexes. Ang β polypeptide gipakunhod gikan sa Gly4 ngadto sa Tyr52 sa RC-LH116, ug gikan sa Ser5 ngadto sa Tyr52 sa RC-LH114-W. Walay naobserbahan nga densidad nga 3 o 4 ka N-terminal o 13 ka C-terminal residues (Figure S1). Ang mass spectrometry analysis sa mixed RC-LH1 complex nga giandam gikan sa wild-type strain nagpakita nga ang nawala nga rehiyon resulta sa heterologous cleavage niining mga peptide (Figure S1 ug S2). Naobserbahan usab ang N-terminal formylation sa α-Met1 (f). Gipakita sa analysis nga ang α-peptide gilangkoban sa mga residue nga fMet1 hangtod Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, ug ang β-peptide gilangkoban sa mga residue nga Ser2 hangtod Ala53, nga nahiuyon sa low-temperature EM density map.
Ang koordinasyon sa α-His29 ug β-His36 naghimo sa mga BChl nga mag-atubangay; ang matag αβ heterodimer mag-assemble uban sa mga silingan niini aron maporma ang usa ka open loop (RC-LH114-W) o usa ka closed loop (RC-LH116) palibot sa RC Ang exciton coupled pigment array (Figure 1, C ug D). Kung itandi sa 877 nm band sa RC-LH114-W, ang 880 nm absorption red shift sa RC-LH116 kay 3 nm (Figure 2A). Bisan pa, ang circular dichroism spectrum halos parehas (Figure 2B), nga nagpakita nga bisan kung adunay klaro nga kalainan tali sa open ug closed loops, ang lokal nga palibot sa mga BChl parehas kaayo. Ang absorption redshift mahimong resulta sa pagkunhod sa thermal motion ug dugang nga kalig-on sa closed loop (18, 19), ang pagbag-o sa pigment coupling nga gipahinabo sa closed loop (20, 21), o kombinasyon niining duha ka epekto (11).
(A) Ultraviolet/visible/near-infrared absorption spectrum, ang mga peak niini gimarkahan sa ilang katugbang nga mga pigment ug gi-normalize sa BPh peak sa 775 nm. (B) Circular dichroism spectrum nga gi-normalize sa BChl absorbance sa 805 nm. (C ug D) Pinili nga ΔA spectra gikan sa time-resolved absorption spectra sa RC-LH114-W complex (C) ug RC-LH116 complex (D). Para sa mas maayong pagtandi, ang tanang spectra gi-normalize sa ∆A sa −A sa 0.2 ps. (E) Ang rate sa cytochrome c2 oxidation human sa irradiation sa presensya sa lain-laing konsentrasyon sa UQ2 (tan-awa ang Figure S8 para sa hilaw nga datos). (F) Sa mga selula nga gipatubo ubos sa low, medium o high intensity nga kahayag (10, 30 o 300μMm-2 s-1, matag usa), ang protein W ug RC-L subunits sa purified complex ug ang separated membrane ratio. Tinoa ang lebel sa protina pinaagi sa SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ug immunoassay (tan-awa ang Figure S9 para sa hilaw nga datos). Tinoa ang ratio relatibo sa giputli nga RC-LH114-W complex. Ang stoichiometric ratio sa RC-L ngadto sa protein-W sa complex kay 1:1.
Ang mga BChl sa posisyon 1 sa deformed αβ14 loop sa RC-LH114-W (Figure 1, A, C, ug E) mas duol sa RC primary donor (P) og 6.8Å kaysa sa katumbas nga mga BChl sa RC-LH116 (Figure. 1, B, D, ug F, ug Figure S3); bisan pa, ang transient absorption kinetics sa duha ka complexes nagpakita nga para sa RC-LH114-W ug RC-LH116, ang excitation energy transfer time constants gikan sa LH1 ngadto sa RC kay 40 ±4 ug 44 ±3 ps (Figure 2). , C ug D, Figure S4 ug Table S2). Wala usay dakong kalainan sa electronic transfer sulod sa RC (Figure S5 ug may kalabutan nga supplementary text). Nagduda kami nga ang suod nga pagkaparehas sa energy transfer time tali sa LH1 ug RC-P tungod sa parehas nga distansya, anggulo ug potensyal nga enerhiya sa kadaghanan sa BChl sa duha ka LH1 loops. Murag ang pagsuhid sa LH1 energy pattern aron maabot ang minimum nga distansya dili mas paspas kay sa direktang pagbalhin sa enerhiya gikan sa mga suboptimal nga site ngadto sa RC. Ang open-loop LH1 loop sa RC-LH114-W mahimo usab nga moagi sa dili kaayo importante nga thermal motion ubos sa ubos nga temperatura nga kondisyon para sa structural analysis, ug adunay mas taas nga αβ14 ring conformation sa temperatura sa kwarto gikan sa pigmentation distance sa βBChls sa posisyon sa RC 1.
Ang RC-LH116 complex adunay 32 ka BChls ug 16 ka carotenoids, ug ang kinatibuk-ang pagkahan-ay niini parehas sa nakuha gikan sa Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) ug green algae (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Human sa pag-align, gamay ra nga mga deviasyon sa mga posisyon sa αβ heterodimers ang naobserbahan, labi na ang 1-5, 15, ug 16 (Figure S6). Ang presensya sa protein-W adunay dakong epekto sa istruktura sa LH1. Ang tulo ka TMH niini konektado sa mubo nga mga loop, diin ang N-terminal sa lumen nga bahin sa complex ug ang C-terminal sa cytoplasmic nga bahin (Mga Figure 1A ug 3, A hangtod D). Ang Protein-W kay kasagaran hydrophobic (Figure 3B), ug ang TMH2 ug TMH3 nakig-interact sa LH1αβ-14 aron maporma ang usa ka transmembrane surface (Figure 3, B ug E hangtod G). Ang interface gilangkoban sa mga Phe, Leu ug Val residues sa transmembrane region. Kini nga mga residue gipatong-patong sa mga hydrophobic amino acid ug αβ-14 pigments. Ang ubang polar residues nakatampo usab sa interaksyon, lakip ang hydrogen bond tali sa W-Thr68 ug β-Trp42 sa ibabaw sa complex cavity (Figure 3, F ug G). Sa ibabaw sa cytoplasm, ang Gln34 kasikbit sa keto group sa αβ-14 carotenoids. Dugang pa, ang n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) molecule naresolve, ug ang hydrophobic tail niini miabot sa interface tali sa protein-W ug αβ-14, ug ang lipid tail mahimong nahimutang sa lawas. Namatikdan usab namo nga ang mga rehiyon sa resolusyon sa C-terminal sa protina nga W ug RCH duol ra kaayo, apan dili sulod sa gilapdon sa pagporma og piho nga mga interaksyon (Figure 1, A ug E). Bisan pa, mahimong adunay mga interaksyon sa wala pa masulbad nga mga C-terminal amino acid niining duha ka protina, nga mahimong maghatag usa ka mekanismo alang sa pagrekrut sa protina-W atol sa pag-assemble sa RC-LH114-W complex.
(A) Ang Protein-W, nga nag-atubang sa interface sa LH1αβ14 sa cartoon nga porma, adunay rod-shaped nga side chain (pula), nga gipakita sa usa ka bahin sa electrostatic potential diagram (transparent gray nga nawong nga adunay contour level nga 0.13). (B) Ang Protein-W girepresentahan sa usa ka hydrophobic nga kolor nga nawong. Ang polar ug charged nga mga lugar gipakita sa cyan, ang hydrophobic nga mga lugar gipakita sa puti, ug ang kusog nga hydrophobic nga mga lugar gipakita sa orange. (C ug D) Ang Protein-W girepresentahan sa cartoon, ang oryentasyon niini parehas sa (A) (C), ug gituyok sa 180° (D). Sumala sa posisyon sa han-ay, ang mailhan nga mga residue nagsagop sa usa ka rainbow color scheme, diin ang N-terminal asul ug ang C-terminal pula. (E) Ang Protein-W sa parehas nga pagtan-aw sama sa (A), ug ang mga residue sa interface sa protein-W:LH1 girepresentahan sa mga rod nga adunay gilakip nga mga marka. (F) Ang Protein-W gituyok og 90° kalabot sa (E) ug LH1αβ14 sa cartoon representation, ug kalabot sa interface residues sa bar representation. Ang nagbitay nga mga residue gikan sa beta polypeptide gimarkahan. Ang cofactor gipakita isip usa ka bar nga parehas og kolor sa Figure 1, ang nabungkag nga β-DDM gipakita sa gray, ug ang oxygen gipakita sa pula. (G) Ang view sa (F) gituyok og 180°, diin ang mga prominenteng residue sa gimarkahan nga alpha polypeptide makita.
Ang Protein-W mopuli sa usa ka αβ heterodimer (ang ika-15 sa Figure 1F), sa ingon mapugngan ang pagsira sa loop ug pagkiling sa unang tulo ka αβ heterodimer. Naobserbahan nga ang pinakataas nga anggulo sa pagkahilig sa unang αβ-1 heterodimer relatibo sa normal nga pelikula kay 25° ngadto sa 29° (Figure 1, A ug E), nga naporma sa 2° ngadto sa 8° nga pagkahilig sa αβ-1 sa RC A sharp contrast-LH116 (Figure 1, B ug F). Ang ikaduha ug ikatulo nga heterodimer kay nakakiling sa 12° ngadto sa 22° ug 5° ngadto sa 10°, matag usa. Tungod sa steric hindrance sa RC, ang pagkahilig sa αβ-1 wala maglakip sa ikaduhang pares sa αβ (nga katumbas sa ika-16 nga αβ sa Figure 1F), sa ingon nagporma og klaro nga gintang sa singsing sa LH1 (Figure 1, A ug E). Tungod sa kakulang sa duha ka αβ heterodimers, inubanan sa pagkawala sa upat ka BChl ug duha ka carotenoids, walay carotenoids nga motapot sa twisted αβ-1 subunit, nga moresulta sa usa ka LH114-W ring nga adunay 13 ka carotenoids nga Vegetarian ug 28 ka BChls. Ang mga banabana sa lokal nga resolusyon sa duha ka complexes sa αβ1 hangtod 7 nga mga rehiyon mas ubos kaysa sa nahabilin nga LH1 loop, nga mahimong magpakita sa kinaiyanhong plasticity sa LH1 subunit nga kasikbit sa RC QB site (Figure 4).
Ang mga hulagway sa RC-LH114-W (A ug B) ug RC-LH116 (C ug D) gipakita gikan sa parehas nga top view/side view (A ug B) (A ug C) ug cavity surface sa Fig. 1. (B ug D). Ang mga colored keys gipakita sa tuo.
Ang bugtong laing kinaiya nga core complex nga adunay stoichiometric ratio nga 1:14 mao ang Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Bisan pa, ang protein W ug PufX walay klaro nga homology, ug adunay dakong epekto sa ilang tagsa-tagsa ka LH1 structures. Ang PufX usa ka single TMH nga adunay N-terminal cytoplasmic domain nga nakig-interact sa cytoplasmic nga bahin sa RC-H subunit (13) sa usa ka posisyon nga katumbas sa Rps. palustris LH116αβ-16. Ang PufX nagmugna og channel para sa quinone/quinolone exchange tali sa RC-LH1 ug sa cytochrome bcl complex ug anaa sa tanang Rba. sphaeroides core complex (13). Bisan tuod ang monomer-monomer interface anaa sa Rba. Ang sphaeroides RC-LH1-PufX dimer nahimutang sa posisyon sa pagbugkos sa protina W sa RC-LH114-W, ug ang gintang nga gipahinabo sa PufX ug protina-W naa sa katumbas nga posisyon (Figure S7A). Ang gintang sa RC-LH114-W nahiuyon usab sa hypothetical quinone channel (8) sa Pseudomonas rosea LH1, nga giporma sa mga peptide nga wala’y kalabotan sa protina W o PufX (Figure S7B). Dugang pa, ang quinone channel sa Blc. Ang emerald green nga LH1 nga giporma pinaagi sa pagtangtang sa usa ka γ subunit (7) nahimutang sa parehas nga posisyon (Figure S7C). Bisan kung gipaagi sa lainlaing mga protina, ang pagpakita niining mga quinone/quinolol channel sa usa ka parehas nga posisyon sa RC-LH1 complex daw usa ka pananglitan sa convergent evolution, nga nagpakita nga ang gintang nga gihimo sa protina W mahimong molihok isip usa ka quinone channel.
Ang gintang sa LH114-W loop nagtugot sa pagporma sa usa ka padayon nga rehiyon sa lamad tali sa internal nga wanang sa RC-LH114-W complex ug sa bulk membrane (Figure 1G), imbes nga magkonektar sa duha ka domain pinaagi sa usa ka lungag sa protina sama sa mga protina. Ang RC-LH116 complex susama sa usa ka sirado nga Tch. Needle-like complex (22) (Figure 1H). Tungod kay ang pagsabwag sa quinone pinaagi sa lamad mas paspas kaysa sa pagsabwag pinaagi sa pig-ot nga channel sa protina, ang bukas nga LH114-W loop mahimong magtugot sa mas paspas nga RC turnover kaysa sa sirado nga LH116 loop, ug ang pagsabwag sa quinone ngadto sa RC mahimong mas limitado. Aron masulayan kung ang protina W makaapekto sa pagkakabig sa mga quinones pinaagi sa RC, naghimo kami usa ka cytochrome oxidation assay sa usa ka piho nga konsentrasyon sa ubiquinone 2 (UQ2) (usa ka analogue sa natural nga UQ10 nga adunay mas mubo nga isoprene tail) (Figure 2E). Bisan tuod ang presensya sa chelated quinone nakababag sa tukmang pagtino sa makita nga Michaelis constant (ang RC-LH114-W ug RC-LH116 angayan alang sa 0.2±0.1μM ug 0.5±0.2μM, matag usa), ang pinakataas nga rate sa RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) mas dako og 28±5% kay sa RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Sa sinugdanan among gibanabana nga ang protein-W anaa sa mga 10% sa core complex (16); dinhi, ang occupancy rates sa low-light, medium-light, ug high-light growth cells kay 15±0.6%, 11±1% ug 0.9±0.5, matag usa % (Figure 2F). Ang quantitative comparison sa mass spectrometry nagpakita nga ang pagdugang sa histidine tag wala makapakunhod sa relatibong kadagaya sa protein-W kon itandi sa wild-type strains (P = 0.59), busa kini nga mga lebel dili usa ka artifact sa modified protein-W (Figure S10). Bisan pa, kini nga ubos nga occupancy sa protein-W sa RC-LH1 complex mahimong magtugot sa pipila ka RCs nga mo-flip sa mas paspas nga rate, sa ingon makapamenos sa mas hinay nga quinone/quinolone exchange sa RC-LH116 complex. Among namatikdan nga ang taas nga light occupancy rate dili uyon sa bag-o nga transcriptomics data, nga nagpakita nga ang pufW gene expression motaas ubos sa kusog nga kahayag (Figure S11) (23). Ang kalainan tali sa pufW transcription ug sa protein-W incorporation ngadto sa RC-LH1 complex makalibog ug mahimong nagpakita sa komplikadong regulasyon sa protina.
Sa RC-LH114-W, 6 ka cardiolipin (CDL), 7 ka phosphatidylcholine (POPC), 1 ka phosphatidylglycerol (POPG) ug 29 ka β-DDM nga mga molekula ang gi-allocate ug gi-modelo niini—6 ka CDL, 24 ka POPC, 2 ka POPG ug 12 ka βDDM. RC-LH116 (Figure 5, A ug B). Niining duha ka istruktura, ang CDL halos nahimutang sa cytoplasmic nga bahin sa complex, samtang ang POPC, POPG ug β-DDM kasagaran nahimutang sa luminal nga bahin. Duha ka lipid ug detergent nga mga molekula ang gi-isolate sa αβ-1 hangtod αβ-6 nga rehiyon sa RC-LH114-W complex (Figure 5A), ug lima ang gi-isolate sa katumbas nga rehiyon sa RC-LH116 (Figure 5B). Mas daghang lipid ang nakit-an sa pikas nga bahin sa complex, kasagaran CDL, nga natipon tali sa RC ug αβ-7 hangtod sa αβ-13 (Figure 5, A ug B). Ang ubang structurally resolved lipids ug detergents nahimutang sa gawas sa LH1 ring, ug ang well-resolved acyl chains moabot tali sa LH1 subunits, nga temporaryong gitudlo nga β-DDM sa RC-LH114-W, ug gihubit nga β-DDM sa RC A mixture sa β-DDM ug POPC-LH116. Ang parehas nga posisyon sa chelating lipids ug detergents sa among istruktura nagpakita nga kini mga physiologically relevant binding sites (Figure S12A). Ang mga posisyon sa equivalent molecules sa Tch adunay maayo usab nga consistency. Gentle ug Trv. Ang Strain 970 RC-LH1s (Figure S12, B hangtod E) (9, 12) ug ang hydrogen-bonding residues sa lipid head group nagpakita og maayong konserbasyon sa sequence alignment (Figure S13), nga nagpakita nga ang Conserved CDL nga motapot sa RC (24), kini nga mga site mahimong makonserba sa RC-LH1 complex.
(A ug B) Ang RC-LH114-W (A) ug RC-LH116 (B) nga mga peptide girepresentahan sa mga cartoon, ug ang mga pigment girepresentahan sa mga rod, gamit ang color scheme sa Figure 1. Ang mga lipid gipakita sa pula, ug ang mga detergent gipakita sa abohon. Ang UQ nga nakagapos sa mga RC QA ug QB site kay dilaw, samtang ang isolated nga UQ kay asul. (C ug D) Parehas nga mga panan-aw sa (A) ug (B), nga wala gilakip ang mga lipid. (E hangtod G) Gipadako nga panan-aw sa Q1(E), Q2(F) ug Q3(G) gikan sa RC-LH116, nga adunay mga side chain nga nag-impluwensya sa usag usa. Ang mga hydrogen bond gipakita isip itom nga putol-putol nga linya.
Sa RC-LH116, ang RC QA ug QB UQ, nga miapil sa electron transfer sa proseso sa charge separation, parehong nabungkag sa ilang binding sites. Apan, sa RC-LH114-W, ang QB quinone wala pa masulbad ug hisgutan sa detalye sa ubos. Gawas pa sa QA ug QB quinones, duha ka chelated UQ molecules (nga nahimutang taliwala sa RC ug LH1 rings) ang gi-assign sa RC-LH114-W structure sumala sa ilang well-resolved head groups (nga nahimutang sa Q1 ug Q2, matag usa). space). Figure 5C). Duha ka isoprene units ang gi-assign sa Q1, ug ang density map nagsulbad sa kompletong 10 ka isoprene tails sa Q2. Sa istruktura sa RC-LH116, tulo ka chelated UQ10 molecules (Q1 hangtod Q3, Figure 5D) ang nasulbad, ug ang tanang molekula adunay klaro nga density sa tibuok ikog (Figure 5, D hangtod G). Sa duha ka istruktura, ang mga posisyon sa mga grupo sa ulo sa quinone sa Q1 ug Q2 adunay maayo kaayong pagkaparehas (Figure S12F), ug kini nakig-interact lamang sa RC. Ang Q1 nahimutang sa entrada sa W gap sa RC-LH114-W (Figure 1G ug 5, C, D ug E), ug ang Q2 nahimutang duol sa QB binding site (Figure 5, C, D) ug F). Ang nakonserba nga mga residue sa L-Trp143 ug L-Trp269 duol kaayo sa Q1 ug Q2 ug naghatag og potensyal nga mga interaksyon sa π-stacking (Figure 5, E ug F, ug Figure S12). Ang L-Gln88, 3.0 Å gikan sa distal oxygen sa Q1, naghatag og lig-on nga hydrogen bond (Figure 5E); kini nga residue nakonserba sa tanang RC gawas sa pinakalayo nga relasyon (Figure S13). Ang L-Ser91 konserbatibong gipulihan sa Thr sa kadaghanan sa ubang mga RC (Figure S13), 3.8 Angstroms gikan sa methyl oxygen sa Q1, ug mahimong maghatag og huyang nga hydrogen bond (Figure 5E). Ang Q3 daw walay espesipikong interaksyon, apan nahimutang sa hydrophobic nga rehiyon tali sa RC-M subunit ug sa LH1-α subunit 5 hangtod 6 (Figure 5, D ug G). Ang Q1, Q2 ug Q3 o ang duol nga chelated quinones nasulbad usab sa Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ug Blc. Ang istruktura sa iris (9, 10, 12) nagpunting sa usa ka nakonserba nga auxiliary quinone binding site sa RC-LH1 complex (Figure S12G). Ang lima ka nadugmok nga UQ sa RC-LH116 nahiuyon sa 5.8±0.7 sa matag complex nga gitino pinaagi sa high performance liquid chromatography (HPLC), samtang ang tulo ka nadugmok nga UQ sa RC-LH114-W mas ubos kaysa sa . Ang gisukod nga kantidad nga 6.2±0.3 (Fig. S14) nagpakita nga adunay wala pa masulbad nga mga molekula sa UQ sa istruktura.
Ang pseudo-symmetric L ug M polypeptides adunay tag-lima ka TMH ug nagporma og heterodimer nga naghiusa sa usa ka BChl dimer, duha ka BChl monomers, duha ka bacteriophage (BPh) monomers, ug usa ka non-Heme iron ug usa o duha ka UQ10 molecules. Pinaagi sa presensya sa hydrogen bonds sa terminal ketone group ug sa nailhan nga akumulasyon niini sa Rps, ang mga carotenoid gi-incorporate sa M-subunit, nga ginganlan og cis-3,4-dehydroorhodopin. Species (25). Ang outer membrane domain sa RC-H gi-angkla sa membrane sa usa ka TMH. Ang kinatibuk-ang istruktura sa RC susama sa tulo ka subunit RC sa mga may kalabutan nga species (sama sa Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Ang mga macrocycle sa BChl ug BPh, ang carotenoid backbone ug non-heme iron nagsapaw sulod sa resolution range niining mga istruktura, sama sa UQ10 head group sa QA site ug ang QB quinone sa RC-LH116 (Figure S15).
Ang pagkaanaa sa duha ka RC structures nga adunay lain-laing QB site occupancy rates naghatag ug bag-ong oportunidad sa pagsusi sa makanunayon nga mga pagbag-o sa conformational nga kauban sa QB quinone binding. Sa RC-LH116 complex, ang QB quinone nahimutang sa hingpit nga nakagapos nga "proximal" nga posisyon (26), apan ang pagkabulag sa RC-LH114-W walay QB quinone. Walay QB quinone sa RC-LH114-W, nga makapakurat tungod kay ang complex aktibo, labi pa kay sa RC-LH116 complex nga adunay structurally resolved QB quinone. Bisan tuod ang duha ka LH1 rings nag-chelate og mga unom ka quinones, lima ang structurally resolved sa sirado nga RC-LH116 ring, samtang tulo lang ang structurally limited sa open RC-LH114-W ring. Kini nga dugang nga structural disorder mahimong magpakita sa mas paspas nga pag-ilis sa RC-LH114-W QB sites, mas paspas nga quinone kinetics sa complex, ug dugang nga posibilidad sa pagtabok sa LH1 loop. Among gisugyot nga ang kakulang sa UQ sa RC QB site sa RC-LH114-W mahimong resulta sa mas komplikado ug mas aktibo nga complex, ug ang QB site sa RC-LH114-W diha-diha dayon nga na-freeze sa UQ turnover. Ang espesipikong yugto (ang entrada sa QB site gisirado na) nagpakita sa konpormasyon niini nga kalihokan.
Kung wala ang QB, ang kaubang pagtuyok sa L-Phe217 ngadto sa usa ka posisyon nga dili compatible sa UQ10 binding, tungod kay kini hinungdan sa spatial collision sa unang isoprene unit sa ikog (Figure 6A). Dugang pa, ang klaro nga mga nag-unang pagbag-o sa conformational klaro, labi na ang helix de (mubo nga helix sa loop tali sa TMH D ug E) diin ang L-Phe217 gibalhin ngadto sa QB binding pocket ug ang pagtuyok sa L-Tyr223 (Figure 6A) Aron mabungkag ang hydrogen bond sa M-Asp45 framework ug masirado ang entrada sa QB binding site (Figure 6B). Ang Helix de pivots sa base niini, ang Cα sa L-Ser209 gibalhin sa 0.33Å, samtang ang L-Val221Cα gibalhin sa 3.52Å. Walay makita nga mga pagbag-o sa TMH D ug E, nga mahimong i-superimpose sa duha ka istruktura (Figure 6A). Sa atong nahibaloan, kini ang unang istruktura sa natural nga RC nga nagsira sa QB site. Ang pagtandi sa kompleto (QB-bound) nga istruktura nagpakita nga sa dili pa maminusan ang quinone, gikinahanglan ang pagbag-o sa konpormasyon aron makasulod kini sa quinone. Ang L-Phe217 motuyok aron maporma ang π-stacking interaction uban sa quinone head group, ug ang helix mobalhin pagawas, nga nagtugot sa skeleton sa L-Gly222 ug sa side chain sa L-Tyr223 nga maporma ang hydrogen bond network nga adunay lig-on nga istruktura sa hydrogen bond (Figure 6, A ug C).
(A) Nagsapaw nga kartun sa hologram (L chain, orange/M chain, magenta) ug apo (gray) nga istruktura, diin ang mga importanteng residue gipakita sa porma sa usa ka rod-like nga representasyon. Ang UQ10 girepresentahan sa usa ka yellow nga bar. Ang tuldok-tuldok nga linya nagpakita sa mga hydrogen bond nga naporma sa tibuok istruktura. (B ug C) Ang representasyon sa ibabaw sa apolipoprotein ug sa tibuok nga istruktura sa singsing, nga nagpasiugda sa side chain oxygen sa L-Phe217 nga asul ug L-Tyr223 nga pula, matag usa. Ang L subunit kay orange; ang M ug H subunits walay kolor. (D ug E) Apolipoprotein (D) ug tibuok (E) RC QB sites [kolori sa (A) matag usa] ug Thermophilus thermophilus PSII (berde, asul nga adunay plastic quinone; PDB ID: 3WU2) I-align (58).
Sa wala damha, bisan kung adunay daghang mga istruktura sa mga RC nga kulang sa QB nga walay LH1 nga magamit, ang mga pagbag-o sa konpormasyon nga naobserbahan niini nga pagtuon wala pa gitaho kaniadto. Naglakip kini sa istruktura sa pagkunhod sa QB gikan sa Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ug Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), nga tanan halos parehas sa ilang kinatibuk-ang istruktura sa QB. Ang masusing pagsusi sa 3PRC nagpadayag nga ang mga molekula sa detergent sa LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) nagbugkos sa entrada sa posisyon sa QB, nga mahimong makapugong sa pag-usab sa han-ay ngadto sa usa ka sirado nga konpormasyon. Bisan kung ang LDAO dili madunot sa parehas nga posisyon sa 1EYS o 1OGV, kini nga mga RC giandam gamit ang parehas nga detergent ug busa mahimong makahatag sa parehas nga epekto. Ang istruktura sa kristal sa Rba. Ang Sphaeroides RC nga gi-co-crystallize sa cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) daw adunay sirado nga QB site. Apan, niining kasoha, ang N-terminal nga rehiyon sa RC-M polypeptide (nga nakig-interact sa QB binding site pinaagi sa H bond sa Tyr residue sa Q helix) nagsagop sa dili natural nga conformation, ug ang QB conformational change wala pa masusi (30). Ang makapahupay kay wala pa nato makita kini nga matang sa deformation sa M polypeptide sa RC-LH114-W structure, nga halos parehas sa N-terminal nga rehiyon sa RC-LH116 RC. Kinahanglan usab nga matikdan nga human sa pagwagtang sa detergent-based LH1 antenna, ang apolipoprotein RCs sa PDB nasulbad, nga nagtangtang sa internal quinone pools ug lipids sa gintang tali sa RC ug sa inner surface sa palibot nga LH1 ring (31, 32). Ang RC nagpabilin nga magamit tungod kay kini nagpabilin sa tanan nga mga cofactor, gawas sa madunot nga QB quinone, nga dili kaayo lig-on ug kanunay nga mawala sa panahon sa proseso sa pag-andam (33). Dugang pa, nahibal-an nga ang pagtangtang sa LH1 ug natural nga cyclic lipids gikan sa RC mahimong makaapekto sa mga gimbuhaton, sama sa mubo nga kinabuhi sa charge-separated P+QB-state (31, 34, 35). Busa, among gihunahuna nga ang paglungtad sa lokal nga singsing sa LH1 nga naglibot sa RC mahimong magpadayon sa "sirado" nga QB site, sa ingon mapreserbar ang lokal nga palibot duol sa QB.
Bisan tuod ang apolipoprotein (walay QB quinone) ug ang kompletong istruktura nagrepresentar lamang sa duha ka hulagway sa pagbalhin sa QB site, imbes nga usa ka serye sa mga panghitabo, adunay mga indikasyon nga ang pagbugkos mahimong ma-gated aron mapugngan ang pagbugkos pag-usab sa hydroquinone. Aron mapugngan ang pagpugong sa substrate. Ang interaksyon sa quinolol ug quinone duol sa QB site sa apolipoprotein mahimong lahi, nga mosangpot sa pagsalikway niini sa RC. Dugay nang gisugyot nga ang mga pagbag-o sa conformational adunay papel sa pagbugkos ug pagkunhod sa mga quinones. Ang abilidad sa mga frozen RC sa pagpakunhod sa mga quinones human sa ngitngit nga adaptasyon nadaot (36); Ang X-ray crystallography nagpakita nga kini nga kadaot tungod sa mga QB quinones nga natanggong sa usa ka "distal" nga conformation mga 4.5 Å gikan sa aktibo nga proximal nga posisyon (26), 37). Gisugyot namo nga kini nga distal binding conformation usa ka hulagway sa intermediate nga estado tali sa apolipoprotein ug sa tibuok nga singsing nga istruktura, nga nagsunod sa inisyal nga interaksyon sa quinone ug sa pag-abli sa QB site.
Ang type II RC nga makita sa PSII complex sa pipila ka phototrophic bacteria ug cyanobacteria, algae ug mga tanom adunay structural ug functional conservation (38). Ang structural alignment nga gipakita sa Figure 6 (D ug E) nagpasiugda sa pagkaparehas tali sa PSII RCs ug sa QB site sa bacterial RC complex. Kini nga pagtandi dugay nang usa ka modelo alang sa pagtuon sa suod nga may kalabutan nga mga sistema sa quinone binding ug reduction. Ang nangaging mga publikasyon nagsugyot nga ang mga pagbag-o sa conformational giubanan sa PSII reduction sa mga quinones (39, 40). Busa, kung gikonsiderar ang evolutionary conservation sa RC, kini nga wala pa maobserbahan nga mekanismo sa pagbugkos mahimo usab nga magamit sa QB site sa PSII RC sa oxygenated phototrophic nga mga tanom.
Ang Rps ΔpufW (walay label nga pufW deletion) ug PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W nga gi-express gikan sa natural nga pufW locus) strains. Ang palustris CGA009 gihulagway sa among miaging trabaho (16). Kini nga mga strain ug ang isogenic wild-type parent nakuha gikan sa freezer pinaagi sa pag-streak sa gamay nga gidaghanon sa mga cell sa PYE (matag 5 g litro -1) (gitipigan sa LB sa -80 °C, nga adunay 50% (w/v) glycerol) protein, yeast extract ug succinate) agar [1.5% (w/v)] plate. Ang plate gi-incubate sa tibuok gabii sa kangitngit sa temperatura sa kwarto ubos sa anaerobic nga mga kondisyon, ug dayon gidan-agan sa puti nga kahayag (~50 μmolm-2 s-1) nga gihatag sa OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) sulod sa 3 ngadto sa 5 ka adlaw hangtud nga usa ka kolonya ang mitungha. Usa ka kolonya ang gigamit sa pag-inoculate og 10 ml nga M22+ medium (41) nga gidugangan og 0.1% (w/v) casamino acids (dinhi gitawag nga M22). Ang kultura gipatubo ubos sa ubos nga oxygen nga kondisyon sa kangitngit sa 34°C nga giuyog sa 180 rpm sulod sa 48 ka oras, ug dayon 70 ml sa kultura ang gi-inoculate ubos sa parehas nga mga kondisyon sulod sa 24 ka oras. Usa ka semi-aerobic culture nga adunay volume nga 1 ml ang gigamit sa pag-inoculate og 30 ml sa M22 medium sa usa ka 30 ml nga universal screw-top transparent nga botelya nga bildo ug gi-irradiate gamit ang agitation (~50μmolm-2 s-1) sulod sa 48 ka oras pinaagi sa sterile magnetic force Stirring rod. Dayon 30 ml sa kultura ang gi-inoculate og mga 1 ka litro nga kultura ubos sa parehas nga mga kondisyon, nga gigamit dayon sa pag-inoculate og mga 9 ka litro nga kultura nga gi-ilaw sa ~200 μmolm-2 s-1 sulod sa 72 ka oras. Ang mga selula gi-ani pinaagi sa centrifugation sa 7132 RCF sulod sa 30 minutos, gi-resuspend sa ~10 ml nga 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ug gitipigan sa -20°C hangtod nga gikinahanglan.
Human matunaw, idugang ang pipila ka kristal sa deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) ug duha ka Roche holoenzyme protease inhibitor tablets (Merck, UK) ngadto sa gisuspende nga mga selula. Sa usa ka 20,000 psi French pressure cell (Aminco, USA), ang mga selula gibungkag 8 ngadto sa 12 ka beses. Human makuha ang wala mabuak nga mga selula ug dili matunaw nga mga debris pinaagi sa centrifugation sa 18,500 RCF sulod sa 15 minutos sa 4°C, ang lamad gi-precipitate gikan sa pigmented lysate pinaagi sa centrifugation sa 113,000 RCF sulod sa 2 ka oras sa 43,000°C. Ilabay ang soluble fraction ug i-suspend pag-usab ang colored membrane sa 100 ngadto sa 200 ml nga 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ug i-homogenize hangtud nga wala nay makita nga mga aggregate. Ang gisuspinde nga lamad gi-incubate sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) nga adunay 2% (w/v) β-DDM sulod sa 1 ka oras sa ngitngit nga lugar sa 4°C nga hinayhinay nga gikutaw. Dayon i-centrifuge sa 70°C aron matunaw ang 150,000 RCF sa 4°C sulod sa 1 ka oras aron makuha ang nahabilin nga dili matunaw nga mga sangkap.
Ang solubilizing membrane gikan sa ΔpufW strain gi-apply sa usa ka 50 ml DEAE Sepharose ion exchange column nga adunay tulo ka column volumes (CV) sa binding buffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) nga adunay 0.03% (w/v) β-DDM]. Hugasi ang column gamit ang duha ka CV binding buffers, ug dayon hugasi ang column gamit ang duha ka binding buffers nga adunay 50 mM NaCl. Ang RC-LH116 complex gi-elute nga adunay linear gradient nga 150 hangtod 300 mM NaCl (sa binding buffer) sa 1.75 CV, ug ang nahabilin nga binding complex gi-elute gamit ang binding buffer nga adunay 300 mM NaCl sa 0.5 CV. Kolektaha ang absorption spectrum tali sa 250 ug 1000 nm, ipadayon ang fraction nga adunay absorbance ratio (A880/A280) nga mas dako kay sa 1 sa 880 ngadto sa 280 nm, tunawi kini kaduha sa binding buffer, ug gamita pag-usab ang samang pamaagi sa DEAE column. Sa purification. I-dilute ang mga fraction nga adunay A880/A280 ratios nga mas taas kay sa 1.7 ug A880/A805 ratios nga mas taas kay sa 3.0, himoa ang ikatulong hugna sa ion exchange, ug ipadayon ang mga fraction nga adunay A880/A280 ratios nga mas taas kay sa 2.2 ug A880/A805 ratios nga mas taas kay sa 5.0. Ang partially purified complex gi-concentrate ngadto sa ~2 ml sa usa ka Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK), ug gikarga sa usa ka Superdex 200 16/600 size exclusion column (GE Healthcare, US) nga adunay 200 mM NaCl buffer, ug dayon gi-elute sa samang buffer sa 1.5 CV. Kolektaha ang absorption spectra sa size exclusion fraction, ug i-concentrate ang absorption spectra gamit ang A880/A280 ratios nga labaw sa 2.4 ug A880/A805 ratios nga labaw sa 5.8 ngadto sa 100 A880, ug dayon gamita kini alang sa cryo-TEM grid preparation o storage. Ibutang sa -80°C hangtod nga gikinahanglan.
Ang solubilizing membrane gikan sa PufW-His strain gigamit sa usa ka 20 ml nga HisPrep FF Ni-NTA Sepharose column (20 mM tris-HCl (pH 8.0) nga adunay 200 mM NaCl ug 0.03% (w/w)) sa IMAC buffer (GE Healthcare). v) β-DDM]. Ang column gihugasan gamit ang lima ka CV sa IMAC buffer, ug dayon gamit ang lima ka CV sa IMAC buffer nga adunay 10 mM histidine. Ang core complex gi-elute gikan sa column gamit ang lima ka IMAC buffer nga adunay 100 mM histidine. Ang fraction nga adunay RC-LH114-W complex gi-concentrate ngadto sa ~10 ml sa usa ka stirred tank nga adunay Amicon 100,000 MWCO filter (Merck, UK), gi-dilute og 20 ka beses gamit ang binding buffer, ug dayon gidugang sa 25 ml. Sa DEAE Sepharose column, upat ka CV nga gi-bound sa buffer ang gigamit daan. Hugasi ang kolum gamit ang upat ka CV binding buffers, dayon i-elute ang complex sa walo ka CV sa linear gradient nga 0 hangtod 100 mM NaCl (sa binding buffer), ug ang nahibiling upat ka CV nga adunay 100 mM binding buffer. Ang mga residual complexes nga gi-elute sa sodium chloride nga gihiusa sa A880/A280 ratio nga mas taas kay sa 2.4 ug ang A880/A805 ratio nga mas taas kay sa 4.6 ka fractions gi-concentrate ngadto sa ~2 ml sa Amicon 100,000 MWCO centrifugal filter, ug gipuno og 1.5 CV IMAC daan. Gi-equilibrate sa Buffer ang Superdex 200 16/600 size exclusion column, ug dayon gi-elute sa samang buffer sa ibabaw sa 1.5 CV. Kolektaha ang absorption spectra sa size-exclusion fractions ug i-concentrate ang absorption spectra gamit ang A880/A280 ratios nga sobra sa 2.1 ug A880/A805 ratios nga sobra sa 4.6 ngadto sa 100, nga gamiton dayon para sa frozen TEM grid preparation o tipigan sa -80°C hangtod kinahanglanon.
Usa ka Leica EM GP immersion freezer ang gigamit sa pag-andam sa mga low temperature TEM grids. Ang complex gi-dilute sa IMAC buffer ngadto sa A880 nga 50, ug dayon 5μl ang gi-load sa bag-ong glow-discharged nga QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK). I-incubate ang grid sa 20°C ug 60% relative humidity sulod sa 30 segundos, dayon i-blot kini og uga sulod sa 3 segundos, ug dayon i-quench kini sa liquid ethane sa -176°C.
Ang datos sa RC-LH114-W complex girekord sa eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) gamit ang Titan Krios microscope, nga mogana sa accelerating voltage nga 300kV, nga adunay nominal magnification nga 130,000× ug enerhiya nga 20 eV. Usa ka Gatan 968 GIF Quantum nga adunay K2 peak detector ang gigamit sa pagrekord sa mga imahe sa counting mode aron mangolekta og datos. Ang calibrated pixel size kay 1.048Å, ug ang dose rate kay 3.83 e-Å-2s-1. Gikolekta ang salida sulod sa 11 segundos ug gibahin kini sa 40 ka bahin. Gamita ang carbon-coated area aron i-refocus ang microscope, ug dayon kolektahon ang tulo ka salida kada lungag. Sa kinatibuk-an, 3130 ka salida ang nakolekta, nga adunay defocus values ​​tali sa -1 ug -3μm.
Ang datos para sa RC-LH116 complex gikolekta gamit ang samang mikroskopyo sa Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). Ang datos gikolekta sa counting mode nga adunay magnification nga 130 k, ug ang gidak-on sa pixel gi-calibrate ngadto sa 1.065 Å nga adunay dose nga 4.6 e-Å-2s-1. Ang salida narekord sulod sa 12 segundos ug gibahin sa 48 ka bahin. Sa kinatibuk-an, 3359 ka salida ang nakolekta, nga adunay mga defocus value tali sa -1 ug -3μm.
Ang tanang pagproseso sa datos gihimo sa Relion 3.0 pipeline (42). Gamita ang Motioncorr 2 (43) aron matul-id ang paglihok sa beam pinaagi sa dose weighting, ug dayon gamita ang CTFFIND 4.1 (44) aron mahibal-an ang CTF (contrast transfer function) parameter. Ang tipikal nga mga photomicrograph human niining inisyal nga mga yugto sa pagproseso gipakita sa Figure 2. S16. Ang awtomatikong template sa pagpili gihimo pinaagi sa mano-manong pagpili sa mga 250 ka pixel nga adunay 1000 ka mga partikulo sa usa ka 250-pixel frame ug walay reference two-dimensional (2D) nga klasipikasyon, sa ingon gisalikway ang mga klasipikasyon nga nakab-ot ang kontaminasyon sa sample o walay mailhan nga mga kinaiya. Dayon, gihimo ang awtomatikong pagpili sa tanang microphotograph, ug ang RC-LH114-W kay 849,359 ka mga partikulo, ug ang RC-LH116 complex kay 476,547 ka mga partikulo. Ang tanang napili nga mga partikulo nakaagi sa duha ka hugna sa non-reference 2D classification, ug human sa matag pagdagan, ang mga partikulo nga nakatagbo sa carbon area, sample contamination, walay klaro nga mga bahin o kusog nga nagsapaw nga mga partikulo gisalikway, nga miresulta sa 772,033 (90.9%) ug 359,678 (75.5%) ) nga mga partikulo gigamit alang sa 3D classification sa RC-LH114-W ug RC-LH116 matag usa. Ang inisyal nga 3D reference model gihimo gamit ang stochastic gradient descent method. Gamit ang inisyal nga modelo isip reference, ang mga napili nga partikulo giklasipikar ngadto sa upat ka kategorya sa 3D. Gamit ang modelo niini nga kategorya isip reference, himoa ang 3D refining sa mga partikulo sa pinakadako nga kategorya, dayon gamita ang inisyal nga 15Å low-pass filter aron matabonan ang solvent area, idugang ang 6 ka pixel nga humok nga mga kilid, ug i-post-process ang mga pixel aron matul-id ang Gatan K2 peak Modulation transfer function sa ibabaw nga detector. Para sa RC-LH114-W dataset, kini nga inisyal nga modelo giusab pinaagi sa pagtangtang sa kusog nga densidad sa mga ngilit sa maskara (nga wala konektado sa core complex density sa UCSF Chimera). Ang resulta nga mga modelo (ang mga resolusyon sa RC-LH114-W ug RC-LH116 kay 3.91 ug 4.16 Å, matag usa) gigamit isip reperensya para sa ikaduhang hugna sa 3D classification. Ang mga partikulo nga gigamit gi-grupo sa inisyal nga 3D class ug walay kusog nga korelasyon sa kasilinganan. Nagsapaw o walay klaro nga mga bahin sa istruktura. Human sa ikaduhang hugna sa 3D classification, ang kategorya nga adunay pinakataas nga resolusyon ang gipili [Para sa RC-LH114-W, ang usa ka kategorya kay 377,703 ka partikulo (44.5%), para sa RC-LH116, adunay duha ka kategorya, nga mokabat sa 260,752 ka partikulo (54.7%), diin parehas ra sila kung i-align human sa inisyal nga rotation nga adunay gamay nga kalainan]. Ang mga napili nga partikulo gi-re-extract sa usa ka 400-pixel box ug gi-refine pinaagi sa 3D refining. Ang solvent mask gihimo gamit ang inisyal nga 15Å low-pass filter, 3 pixel map expansion ug 3 pixel soft mask. Gamit ang per-particle CTF refinement, per-particle motion correction ug ang ikaduhang hugna sa per-particle CTF refinement, 3D refinement, solvent masking ug post-processing gihimo human sa matag lakang aron ma-refine pa ang resulta nga texture. Gamit ang FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off value nga 0.143, ang mga resolusyon sa katapusang mga modelo sa RC-LH114-W ug RC-LH116 kay 2.65 ug 2.80Å, matag usa. Ang FSC curve sa katapusang modelo gipakita sa Figure 2. S17.
Ang tanang mga han-ay sa protina gi-download gikan sa UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Ang SWISS-MODEL (45) gigamit sa paghimo og homology model sa RC, nga naglangkob sa mga han-ay sa protina sa RC-L, RC-M ug RC-H ug ang istruktura sa kristal sa Rba. Ang sphaeroides RC gigamit isip template (PDB ID: 5LSE) (46). Gamita ang himan nga "fit map" sa UCSF Chimera aron ihaom ang nahimo nga modelo sa mapa (47), pauswaga ang istruktura sa protina, ug cofactor [4×BChl a (ngalan sa residue sa monomer library = BCL), 2×BPh a (BPH), usa o duha ka klase sa UQ10 (U10), usa ka non-heme iron (Fe) ug usa ka 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] gamita ang Coot (48) aron idugang. Tungod kay ang QAK dili magamit sa monomer library, kini gi-parameterize gamit ang himan nga eLBOW sa PHENIX (49).
Sunod, gitukod ang LH1 subunit. Sa sinugdanan, ang automatic construction tool sa PHENIX (49) gigamit aron awtomatikong matukod ang bahin sa LH1 sequence gamit ang map ug ang LH1-α ug LH1-β protein sequences isip input. Pilia ang pinakakompleto nga LH1 subunit, kuhaa kini ug i-load kini sa Coot, mano-mano nga idugang ang nawala nga sequence niini, ug mano-mano nga i-refine ang tibuok nga istruktura sa dili pa idugang ang duha ka BCl (BCL) ug usa ka spirilloxanthin (CRT) [sumala sa may kalabutan nga Rps Ang density sa LH1 complex ug ang nahibal-an nga carotenoid content. Species (17)]. Kopyaha ang kompleto nga LH1 subunit, ug gamita ang UCSF Chimera “Docking Map Tool” aron i-dock sa kasikbit nga non-model area sa LH1 density, ug dayon i-refine kini sa Coot; balika ang proseso hangtod nga ang tanan nga LH1 subunit na-modelo na. Para sa RC-LH114-W nga istruktura, pinaagi sa pagkuha sa unallocated density sa Coot, ang protina gi-segment gikan sa nahibiling non-protein components sa USCF Chimera map ug ang Autobuild tool gigamit aron maestablisar ang initial model, ug ang nahibiling subunits (protein-W) Modeling. Sa PHENIX (49). Idugang ang bisan unsang nawala nga mga sequence sa resulta nga modelo sa Coot (48), ug dayon mano-mano nga i-refine ang tibuok subunit. Ang nahibiling unallocated density mohaom sa kombinasyon sa mga lipid (PDB monomer library ID sa CDL = CDL, POPC = 6PL ug POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) ug UQ10 molecules (U10). Gamita ang PHENIX optimization (49) ug manual optimization sa Coot (48) aron maperpekto ang kompletong initial model hangtod nga ang model statistics ug ang visual quality sa fit dili na mapaayo pa. Sa katapusan, gamita ang LocScale (50) aron mahait ang local map, ug dayon paghimo og daghang uban pang mga cycle sa pagmodelo sa unallocated density ug automatic ug manual optimization.
Ang tagsa-tagsa ka peptide, cofactor ug uban pang lipid ug quinones nga gilakip sa ilang tagsa-tagsa ka densidad gipakita sa Mga Hulagway 1 ug 2. S18 hangtod S23. Ang estadistikal nga impormasyon sa katapusang modelo gipakita sa Talaan S1.
Gawas kon lahi ang giingon, ang UV/Vis/NIR absorption spectra gikolekta sa usa ka Cary60 spectrophotometer (Agilent, USA) sa 1 nm intervals gikan sa 250 nm ngadto sa 1000 nm ug usa ka integration time nga 0.1s.
I-dilute ang sample sa usa ka quartz cuvette nga adunay 2 mm nga agianan ngadto sa A880 nga 1, ug kolektaha ang absorption spectrum tali sa 400 ug 1000 nm. Ang circular dichroic spectra gikolekta sa usa ka Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japan) sa 1 nm nga mga interval tali sa 400 nm ug 950 nm sa scan rate nga 20 nm min-1.
Ang molar extinction coefficient gitino pinaagi sa pag-dilute sa core complex ngadto sa A880 nga gibana-bana nga 50. I-dilute ang 10μl nga volume sa 990μl binding buffer o methanol, ug kolektaha dayon ang absorption spectrum aron maminusan ang BChl degradation. Ang BChl content sa matag methanol sample gikalkulo pinaagi sa extinction coefficient sa 771 nm nga 54.8 mM-1 cm-1, ug ang extinction coefficient gitino (51). Bahina ang gisukod nga BChl concentration sa 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) aron mahibal-an ang core complex concentration, nga gamiton dayon aron mahibal-an ang absorption spectrum sa parehas nga sample nga nakolekta sa buffer Extinction coefficient. Tulo ka balik-balik nga pagsukod ang gikuha alang sa matag sample, ug ang average absorbance sa BChl Qy maximum gigamit alang sa pagkalkulo. Ang extinction coefficient sa RC-LH114-W nga gisukod sa 878 nm kay 3280±140 mM-1 cm-1, samtang ang extinction coefficient sa RC-LH116 nga gisukod sa 880 nm kay 3800±30 mM-1 cm-1.
Ang UQ10 gi-quantify sumala sa pamaagi sa (52). Sa laktod nga pagkasulti, ang reverse phase HPLC (RP-HPLC) gihimo gamit ang Agilent 1200 HPLC system. Tunawa ang mga 0.02 nmol sa RC-LH116 o RC-LH114-W sa 50μl sa 50:50 methanol:chloroform nga adunay 0.02% (w/v) ferric chloride, ug i-inject ang pre-equilibrated Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Tunawa sa 1 ml-1 min-1 sa 40°C sa HPLC solvent (80:20 methanol:2-propanol) sa usa ka ×25 cm nga kolum. Paghimo og isocratic elution sa usa ka HPLC solvent aron mabantayan ang absorbance sa 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) ug 780 nm (BChl) sulod sa 1 ka oras. Ang kinatas-ang resulta sa 275 nm chromatogram sa 25.5 minutos gi-integrate, nga walay laing makita nga mga compound. Ang integrated area gigamit sa pagkalkulo sa molar amount sa UQ10 nga nakuha gamit ang reperensya sa calibration curve nga gikalkulo gikan sa injection sa puro nga mga standard gikan sa 0 ngadto sa 5.8 nmol (Figure S14). Ang matag sample gi-analisa sa tulo ka replicates, ug ang gitaho nga error katumbas sa SD sa average.
Usa ka solusyon nga adunay RC-LH1 complex nga adunay maximum Qy absorption nga 0.1 ang giandam gamit ang 30 μM reduced horse heart cytochrome c2 (Merck, UK) ug 0 hangtod 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tulo ka 1-ml nga sample ang giandam sa matag konsentrasyon sa UQ2 ug gi-incubate sa tibuok gabii sa kangitngit sa 4°C aron masiguro ang kompleto nga pagpahiangay sa kangitngit sa dili pa ang pagsukod. Ang solusyon gikarga sa usa ka OLIS RSM1000 modular spectrophotometer nga adunay 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm middle ug 0.6 mm outlet slits. Usa ka 600 nm long pass filter ang gibutang sa entrada sa sample phototube ug sa reference photomultiplier tube aron dili makasulod ang excitation light. Ang absorbance gimonitor sa 550 nm nga adunay integration time nga 0.15 s. Ang excitation light gipagawas gikan sa 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) pinaagi sa fiber optic cable sa 90% nga intensity pinaagi sa DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) ug gipagawas ngadto sa tinubdan sa kahayag sa anggulo nga 90°. Ang measuring beam giatubang sa salamin aron ibalik ang bisan unsang kahayag nga wala masuhop sa sample sa sinugdanan. Monitora ang absorbance 10 s sa dili pa ang illuminance nga 50 s. Dayon ang absorbance gimonitor pa sulod sa 60 s sa kangitngit aron masusi ang gidak-on diin ang quinolol kusang nagpakunhod sa cytochrome c23+ (tan-awa ang Figure S8 para sa hilaw nga datos).
Ang datos giproseso pinaagi sa pag-fit sa linear initial rate sulod sa 0.5 ngadto sa 10 s (depende sa konsentrasyon sa UQ2) ug pag-average sa mga rate sa tanang tulo ka sample sa matag konsentrasyon sa UQ2. Ang konsentrasyon sa RC-LH1 nga gikalkulo sa tagsa-tagsa ka extinction coefficient gigamit aron i-convert ang rate ngadto sa catalytic efficiency, nga gi-plot sa Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), ug gi-fit sa Michaelis-Menten model aron mahibal-an ang makita nga mga kantidad sa Km ug Kcat.
Para sa mga transient absorption measurements, ang RC-LH1 sample gi-dilute ngadto sa ~2μM sa IMAC buffer nga adunay 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) ug 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Ang ascorbic acid gigamit isip sacrificial electron donor, ug ang tert-butaclofen gigamit isip QB inhibitor aron masiguro nga ang main RC donor magpabilin nga nakunhoran (nga mao, dili photooxidized) sa tibuok proseso sa pagsukod. Gibana-bana nga 3 ml nga sample ang gidugang sa usa ka custom rotating cell (mga 0.1 m ang diametro, 350 RPM) nga adunay 2 mm optical path length aron masiguro nga ang sample sa laser path adunay igong panahon para sa dark adaptation tali sa excitation pulses. Gamita ang ~100-fs laser pulses aron ma-amplify ang Ti: Sapphire laser system (Spectra Physics, USA) aron ma-excite ang sample sa 880 nm sa repetition rate nga 1 kHz (20 nJ para sa NIR o 100 nJ para sa Vis). Sa dili pa mangolekta og datos, ibutyag ang sample sa excitation light sulod sa mga 30 minutos. Ang pagkaladlad hinungdan sa QA inactivation (posibleng makunhuran ang QA kausa o kaduha). Apan palihug timan-i nga kini nga proseso mabalik tungod kay human sa taas nga panahon sa pagpahiangay sa kangitngit, ang RC hinayhinay nga mobalik sa QA nga kalihokan. Usa ka Helios spectrometer (Ultrafast Systems, USA) ang gigamit sa pagsukod sa transient spectra nga adunay delay time nga -10 hangtod 7000 ps. Gamita ang Surface Xplorer software (Ultrafast Systems, USA) aron i-ungroup ang mga data sets, dayon i-merge ug i-standardize. Gamita ang CarpetView software package (Light Conversion Ltd., Lithuania) aron gamiton ang combined data set aron makakuha og differential spectra nga may kalabutan sa decay, o gamita ang usa ka function nga maghiusa sa daghang exponents sa instrument response aron mohaom sa single-wavelength spectral evolution sa Origin (OriginLab, USA).
Sama sa nahisgotan sa ibabaw (53), usa ka photosynthetic film nga adunay LH1 complex nga kulang sa RC ug peripheral LH2 antenna ang giandam. Ang membrane gi-dilute sa 20 mM tris (pH 8.0) ug dayon gi-load sa usa ka quartz cuvette nga adunay 2 mm optical path. Usa ka 30nJ laser pulse ang gigamit aron ma-excite ang sample sa 540 nm nga adunay delay time nga -10 hangtod 7000 ps. Iproseso ang data set sama sa gihulagway para sa Rps. pal sample.
Ang lamad gi-pellet pinaagi sa centrifugation sa 150,000 RCF sulod sa 2 ka oras sa 4°C, ug dayon ang absorbance niini sa 880 nm gi-resuspend sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ug 200 mM NaCl. Tunawa ang lamad pinaagi sa hinay nga pagsagol sa 2% (w/v) β-DDM sulod sa 1 ka oras sa ngitngit nga lugar sa 4°C. Ang sample gi-dilute sa 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ngadto sa konsentrasyon sa protina nga 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). Dugang nga pagproseso ang gihimo gikan sa naunang gipatik nga pamaagi (54), sugod sa pag-dilute sa 50 μg nga protina ngadto sa kinatibuk-an nga 50 μl TEAB nga adunay 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Human sa sonication sulod sa 60 segundos, kini gi-reduce gamit ang 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) sa 37°C sulod sa 30 minutos. Para sa S-alkylation, i-incubate ang sample gamit ang 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ug idugang kini gikan sa 200 mM isopropanol stock solution sulod sa 10 minutos sa temperatura sa kwarto. Ang proteolytic digestion gihimo pinaagi sa pagdugang og 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mixture (Promega UK) ug gi-incubate sa 37°C sulod sa 3 ka oras. Ang laurate surfactant gi-extract pinaagi sa pagdugang og 50 μl ethyl acetate ug 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ug vortexing sulod sa 60 segundos. Ang phase separation gi-promote pinaagi sa centrifugation sa 15,700 RCF sulod sa 5 minutos. Subay sa protocol sa tiggama, usa ka C18 spin column (Thermo Fisher Scientific, UK) ang gigamit aron maampingong i-aspirate ug i-desalt ang ubos nga phase nga adunay peptide. Human mamala pinaagi sa vacuum centrifugation, ang sample gitunaw sa 0.5% TFA ug 3% acetonitrile, ug ang 500 ng gi-analisa pinaagi sa nanoflow RP chromatography nga giubanan sa mass spectrometry gamit ang mga parameter sa sistema nga gidetalye kaniadto.
Gamita ang MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para sa pag-ila ug pagkwenta sa protina aron pangitaon ang Rps. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Ang datos sa mass spectrometry proteomics gideposito na sa ProteomeXchange Alliance pinaagi sa PRIDE partner repository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ubos sa dataset identifier nga PXD020402.
Para sa pag-analisa gamit ang RPLC inubanan sa electrospray ionization mass spectrometry, ang RC-LH1 complex giandam gikan sa wild-type Rps. Gamit ang naunang gipatik nga pamaagi (16), ang konsentrasyon sa protina nga gihimo sa mga selula sa palustris kay 2 mg ml-1 sa 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl ug 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM. Sumala sa protocol sa tiggama, gamita ang 2D purification kit (GE Healthcare, USA) aron makuha ang 10 μg nga protina pinaagi sa precipitation method, ug tunawon ang precipitate sa 20 μl 60% (v/v) formic acid (FA), 20% (v/v) Acetonitrile ug 20% ​​(v/v) nga tubig. Lima ka microliters ang gi-analisa gamit ang RPLC (Dionex RSLC) inubanan sa mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gamita ang MabPac 1.2×100 mm column (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa pagbulag sa 60°C ug 100μlmin -1, nga adunay gradient nga 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA ug 0.02% (V/v) TFA aqueous solution] ngadto sa 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA ug 0.02%(v/v) sa 90%(v/v) acetonitrile TFA] Gamit ang standard electrospray ionization source ug default parameters sulod sa sobra sa 60 minutos, ang mass spectrometer makakuha og 100 ngadto sa 2750 m/z (mass-to-charge ratio). Uban sa tabang sa ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), i-map ang mass spectrum ngadto sa mga subunit sa complex.
Ang mga selula gipatubo sulod sa 72 ka oras ubos sa 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) o high (300μMm-2 s-1) nga suga. M22 medium (M22 medium diin ang ammonium sulfate wala gigamit ug ang sodium succinate gipulihan sa sodium acetate) sa usa ka 100 ml nga botelya nga may screw-top (23). Sa lima ka 30-s nga siklo, ang 0.1 micron nga glass beads gi-bead sa volume ratio nga 1:1 aron ma-lyse ang mga selula ug gipabugnaw sa yelo sulod sa 5 ka minuto. Ang dili matunaw nga butang, wala mabuak nga mga selula ug mga glass beads gikuha pinaagi sa centrifugation sa 16,000 RCF sulod sa 10 ka minuto sa usa ka benchtop microcentrifuge. Ang lamad gibulag sa usa ka Ti 70.1 rotor nga adunay 100,000 RCF sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) nga adunay 40/15% (w/w) sucrose gradient sulod sa 10 ka oras.
Sama sa gihulagway sa among miaging trabaho, ang immunodetection sa His tag sa PufW (16). Sa laktod nga pagkasulti, ang purified core complex (11.8 nM) o ang lamad nga adunay parehas nga konsentrasyon sa RC (gitino pinaagi sa oxidation nga gikubkob ang reduced difference spectrum ug gipares ang load sa stained gel) sa 2x SDS loading buffer (Merck, UK) gi-dilute kaduha. Ang mga protina gibulag sa usa ka replica 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Usa ka gel ang gi-stain gamit ang Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) aron ma-load ug ma-visualize ang RC-L subunit. Ang protina sa ikaduhang gel gibalhin ngadto sa methanol-activated polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa immunoassay. Ang PVDF membrane gibabagan sa 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 ug 5% (w/v) skimmed milk powder, ug dayon gi-incubate uban sa anti-His primary antibody (sa Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl ug 0.05% (v/v) Tween-20] sa 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) sulod sa 4 ka oras. Human sa paghugas og 3 ka beses sulod sa 5 ka minuto sa antibody buffer, ang membrane gisagol sa horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (gi-dilute og 1:10,000 sa antibody buffer). I-incubate aron ma-detect (5 ka minuto human sa 3 ka paghugas sa antibody buffer) gamit ang WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italy) ug Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Pinaagi sa pagdrowing sa intensity distribution sa matag stained gel o immunoassay lane, pag-integrate sa area ubos sa peak ug pagkalkulo sa intensity ratio sa RC-L (stained gel) ug Protein-W (immunoassay), sa ImageJ (57) Iproseso ang imahe. Kini nga mga ratio gi-convert ngadto sa molar ratios pinaagi sa pag-assume nga ang ratio sa RC-L ngadto sa protein-W sa puro nga RC-LH114-W sample kay 1:1 ug pag-normalize sa tibuok data set sumala niana.
Para sa dugang nga mga materyales para niining artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Kini usa ka open access nga artikulo nga giapod-apod ubos sa mga termino sa Creative Commons Attribution License. Gitugotan sa artikulo ang walay pugong nga paggamit, pag-apod-apod, ug pagkopya sa bisan unsang medium ubos sa kondisyon nga ang orihinal nga buhat gikutlo sa husto.
Pahinumdom: Among gihangyo lang nga ihatag nimo ang imong email address aron ang tawo nga imong girekomenda sa panid mahibalo nga gusto nimo nga makita nila ang email ug nga dili kini spam. Dili kami mokuha og bisan unsang email address.
Kini nga pangutana gigamit aron pagsulay kung ikaw usa ka bisita ug mapugngan ang awtomatikong pagsumite sa spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ang high-resolution nga istruktura sa light trap 1 complex sa reaction center naghatag og bag-ong mga panabut sa quinone dynamics.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ang high-resolution nga istruktura sa light trap 1 complex sa reaction center naghatag og bag-ong mga panabut sa quinone dynamics.
©2021 American Association for the Advancement of Science. ang tanan nga mga katungod gigahin. Ang AAAS kauban sa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ug COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.